Interior Archives_1(2013)_000pag_2-6 - RAMI Editorial Board

ROMANIAN ARCHIVES 

OF 

MICROBIOLOGY 

AND 

IMMUNOLOGY 

Founded by 

PROFESSOR ION CANTACUZINO 

VOLUME 72 - Issue 1 

January - March 2013 

Published quarterly 

by 

CANTACUZINO INSTITUTE BUCHAREST 

TOTAL PUBLISHING HOUSE

ROMANIAN ARCHIVes OF MICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY 

ROMANIAN ARCHIVES 

OF 

MICROBIOLOGY 

AND 

IMMUNOLOGY 

ISSN 1222-3891 

INDEXED IN MEDLINE 

CNCSIS Category B+ 

Editor-in-Chief: Radu IORDĂCHEL 

Deputy Editor: Maria DAMIAN 

Editorial Board: Viorel ALEXANDRESCU, Antonios ANTONIADIS, Jean-Marc CAVAILLON, 

Ana CĂLUGĂRU, Cornelia CEIANU, Carmen CHIFIRIUC, Nicolae CORCIONIVOSCHI, 

Angel GALABOV, Steliana HUHULESCU, Luminiţa Smaranda IANCU, Anca ISRAIL, 

Emilia LUPULESCU, Roxana MOLDOVAN, Geza MOLNAR; Marian NEGUŢ, Adrian ONU, 

Hervé PELLOUX, Graţiela PÎRCĂLĂBIORU, Dorel Lucian RADU, Alexandru RAFILA, 

Aurora SĂLĂGEANU, Constantin SPÂNU, Demetrios SPANDIDOS, Dan STERIU, 

Cătălina-Suzana STÎNGU, Galina TSENEVA, Codruţa-Romaniţa USEIN, Hans WOLF, 

Imola ZIGONEANU 

Editorial Staff: Felicia RAPILAT, Monica TRĂISTARU 

TOTAL PUBLISHING HOUSE 

Subscription orders: 

Orders can be placed directly with the publisher: 

„Cantacuzino“ National Institute of Research-Development for Microbiology and Immunology 

C.P. 1-525, splaiul Independentei 103, 050096, Bucureºti, România 

Fax: (40.21)306.93.07 

e-mail: archives@cantacuzino.ro 

www.roami.ro 

Copyright 

© 

2013 CANTACUZINO INsTITUTe Bucharest 

2

ROMANIAN ARCHIVes OF MICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY 

CONTeNTs / sUMAR 

MICROBIOLOGY / MICROBIOLOGIe 

5 UNDeRsTANDING THe MOLeCULAR TARGeTs FOR NeW THeRAPeUTICAL AGeNTs IN HePATITIs C INFeCTION / 

AGeNÞI TeRAPeUTICI CU ACÞIUNe DIReCTÃ ANTIVIRALÃ ÎN INFeCÞIA CU VIRUs HePATITIC C - NOI ÞINTe 

MOLeCULARe 

Codruþa Vagu, Camelia sultana, simona Ruþã 

PARAsITOLOGY / PARAZITOLOGIe 

25 GROWTH OF eNTAMOeBA INVADeNs IN seDIMeNTs WITH MeTABOLICALLY RePResseD 

BACTeRIA LeADs TO MULTICeLLULARITY AND ReDeFINITION OF THe AMOeBIC CeLL sYsTeM / 

seDIMeNTe CU BACTeRII AeROBe RePRIMATe MeTABOLIC eLUCIDeAZÃ LA EntamoEba invadEns 

sIsTeMUL MULTICeLULAR ŞI CICLUL De VIAÞÃ AMIBIAN 

Vladimir F. Niculescu 

49 TWO CAse RePORTs ON VIsCeRAL LeIsHMANIAsIs DIAGNOseD IN ROMANIA / 

DOUÃ RAPOARTe De CAZURI De LeIsHMANIOZÃ DIAGNOsTICATe ÎN ROMâNIA 

Marian Ghervan Gogoaşe, Irina Teodorescu, Carmen Preda, simona Claudia Ionescu 

MINIReVIeW 

63 ADeNYLATe CYCLAses INVOLVeMeNT IN PATHOGeNICITY, A MINIReVIeW / 

IMPLICAReA ADeNILAT CICLAZeLOR ÎN PATOGeNITATe, UN MINIReVIeW 

Adriana Costache, Nadia Bucurenci, Adrian Onu 

VOLUMe 72 IssUe 1 JANUARY - MARCH 2013 

3

INsTRUCTIONs TO AUTHORs 

Aims and Scope 

Romanian archives of microbiology and immunoloy, an international 

journal dedicated to original research work, publishes papers focusing 

on various aspects of microbiology and immunology. Romanian ar chives 

of microbiology and immunology is indexed in MeDLINe. The frequency 

of the Journal is currently four issues per year. 

Categories of manuscripts 

Full-length articles are full-length descriptions of original research (up to 

10 printed pages). 

Reviews are comprehensive appraisals of research in a field of current 

interest. All reviews are subject to the normal review process (up to 12 

printed pages). 

Rapid Communications are brief, definitive reports of highly significant 

and timely findings in the field (up to 5 printed pages). 

Submission of manuscripts 

Manuscripts and all attached files (tables and illustrations) should be submitted 

in electronic form to the editorial Office, e-mail address: 

archives@cantacuzino.ro or by regular mail (address: Redactia Revistei 

Romanian Archives of Microbiology and Immunology, spl. Indepen den - 

tei 103, sector 5, 050096, Bucuresti, Romania) on compact disk, preferrably 

accompanied by three copies of the manuscript, including tables 

and figures, printed on one side of A4 paper format, double-spaced, with 

2.5 margins. 

The preferred software is Microsoft Word. In order to speed up the 

process of review, manuscripts should be prepared very carefully. 

Cover letter 

each manuscript submitted to the Romanian Archives of Microbiology 

and Immunology must be accompanied by a Cover letter including an 

explicit statement by the corresponding author that: 

• the manuscript represents an original work, has not been previously 

published, and has not been submitted simultaneously for publication 

elsewhere. 

• the manuscript, as submitted, has been reviewed and approved by all 

named authors and that all authors concur with the submission and are 

responsible for its content. 

• the Cover letter should be signed by all the authors of a manuscript. 

Editorial review and acceptance 

All manuscripts are subject to editorial review by professional peer reviewers 

(at least two). The acceptance criteria for all manuscripts are 

based on quality and originality. The corresponding author of a manuscript 

is informed within 60 working days after submission that the paper 

is accepted for publication in the journal, needs revision or is rejected. 

Revised manuscripts should be resubmitted as soon as possible but not 

later than 14 days. 

Ethical considerations 

A paper describing any experimental work with humans should include 

a statement that the ethics Committee of the institution in which the work 

was done has approved it, and that the subjects gave informed consent 

to the work. 

experiments with animals should be done in accordance with the legal 

requirements of the relevant local or national authority. Procedures 

should be such that animals used in experiments do not suffer unnecessarily. 

Papers should include details of the procedures and anaesthetics 

used. The editors will not accept papers where the ethical aspects are, in 

their opinion, open to doubt. 

Preparation of manuscripts 

Manuscripts should be submitted in english. American or British spelling 

can be used provided that only one spelling style is consistently used 

throughout. Manuscripts must be typewritten on A4 format (210x297 

mm), with double spacing, margins of 25 mm, on one side only, consecutively 

numbered. Times New Roman font, 12-point size, is required. 

Text headings 

All headings in the text should be set over to the left hand margin, and 

text should begin on the next line. Type first level (sectional) headings 

all in capitals. second level headings should be typed in small (lower 

case) letters but with the first letter of each main word a capital. For third 

level headings, only the first letter of the first word should be a capital. 

Underline first and second level headings. 

FIRsT LeVeL TeXT HeADING 

second Level Text Heading 

Third level text heading 

Manuscripts should be divided into the following sections and order: 

Title page, Abstract and key words, Introduction, Materials and Me thods, 

Results, Discussion, Acknowledgements, References, Tables, Figure Legends 

and Figures. 

1. Title page contains: title of the paper not longer than 80-100 characters, 

including spaces and punctuation; full name of the authors and 

their affiliation; the author responsible for correspondence will be 

marked by an asterisk, and his full address telephone/fax numbers, and 

e-mail address will be indicated. 

2. Abstract must not exceed 250 words and should reflect the content 

of the study. Following the abstract, a list of 3-10 keywords is essential 

for indexing purposes. 

3. Introduction containing a description of the problem under investigation 

and a brief survey of the existing literature on the subject. 

4. Materials and Methods provide sufficient detail to allow the work to 

be reproduced. 

5. Results. Results should be clear and concise. 

6. Discussion that enriches but does not repeat section 3 or 5. 

7. Acknowledgements (if applicable) containing acknowledgement of 

technical help and of financial material support. 

8. References should be numbered consecutively in the order in which 

they are first mentioned in the text. Identify references in text, tables, 

and legends by Arabic numerals in square brackets (e.g. [1], [2-6], etc.). 

Please note the following examples: 

Journals: 

Allain F, Vanpouille C, Carpentier M, Slomianny MC, Durieux S, Spik 

G. Interaction with glycosaminoglycans is required for cy clophilin B 

to trigger integrin-mediated adhesion of peripheral blood T lymphocytes 

to extracellular matrix. Proc Natl Acad sci U s A 2002. 99: 2714- 

2719. 

Books: 

Theofilopoulos AN. Immune complexes in autoimmunity. In: Bona CA, 

siminovitch KA, Zanetti M, Theofilopoulos AN (eds.) The Mole cular 

Pathology of Autoimmune Diseases. Harwood Academic Pu blishers, 

switzerland 1993, pp 229-244. 

9. Tables with suitable captions at the top and numbered with Arabic 

numerals should be collected at the end of the text on separate sheets 

(one page per Table). Footnotes to tables should be marked with a) 

b) c) etc and *, **, *** should be reserved for p values. each table 

must be understood independently of the text. All tables must be cited 

in the text. 

10. Figures (illustrations) Figures should be submitted on separate pages 

at the end of the article (new page for each complete figure). They 

should be numbered in the order of their appearance with Arabic numerals. 

Figures should be submitted as TIFF files at a pro per resolution 

as follows: Graphs at 800-1200 dpi; Photos at 400-800 DPI; Color 

300-400 DPI. Text in figures should be 8-10 point in size. each figure 

must have a separate legend. The legends should not appear under 

the figures, but be gathered in a separate section (Figure legends). 

Color figures can only be printed if the author is prepared to pay the 

cost incurred. 

11. Figure legends should be supplied at the end of the manuscript, double 

spaced, with relevant figure numbers, labeling symbol and explanation. 

Units of measurement, Symbols and abbreviations 

symbols for physical units should be those of the système Internationale 

(sI) Units. 

Alternative or non-sI units may be used, but these must be defined at 

their first occurrence in the text. 

Nomenclature of Microorganisms 

Binary names, consisting of a generic name and a specific epithet (e.g., 

escherichia coli), must be used for all microorganisms. 

Genetic Nomenclature 

To facilitate accurate communication, it is important that standard ge - 

netic nomenclature be used whenever possible and that deviations or 

proposals for new naming systems be endorsed by an appropriate au - 

thoritative body. 

Proofs and reprints 

Ten reprints of each article and one copy of the journal will be supplied 

free of charge to the corresponding author. 

Romanian archives of microbiology and immunology 

4

UNDeRsTANDING THe MOLeCULAR TARGeTs 

FOR NeW THeRAPeUTICAL AGeNTs IN HePATITIs C INFeCTION 

Codruþa Vagu 1 , Camelia Sultana 1,2 , Simona Ruþã 1,2 * 

¹Carol davila University of medicine and Pharmacy, bucharest, Romania 

²Ştefan s. nicolau institute of virology, bucharest, Romania 

ABsTRACT 

Improved understanding of the HCV viral life cycle has led to the identification of numerous potential 

molecular targets for the development of new drugs. Direct acting antivirals –DAAs specifically target 

a viral encoded protein: the NS3-4A protease, involved in the posttranslational viral protein processing; 

the NS5B encoded viral polymerase, that conducts the nucleic acid replication and the NS5A encoded 

phosphoprotein, that participates in both replication and virus assembly. Host-targeted agents, both 

directed to the early steps of viral replication (receptors and coreceptors antagonists) or to the development 

of a functional viral replication complex (host cyclophilins) are also developed, to strengthen 

the antiviral efficacy of these drugs. The newly approved NS3-4A protease inhibitors (telaprevir and 

boceprevir), administered in combination with pegylated interferon and ribavirin for patients with 

HCV genotype 1 infection, determined a significant enhancement in the sustained virologic response 

rates (towards 66-75% in treatment-naive patients and 59-66% in treatment-experienced ones). Improved 

antiviral efficacy was shown in clinical trials by second generation protease inhibitors, while 

valuable alternatives are represented by nucleoside/nucleotide analogues and non-nucleoside inhibitors 

directed to the HCV RNA-dependent RNA polymerase, as well as by NS5A inhibitors (both direct 

acting or directed to the host cofactors). More recently, combinations of different drugs are tested as 

a potential cure for chronic hepatitis C. 

Keywords: HCV life cycle, HCV entry inhibitors, HCV protease inhibitors, HCV polymerase inhibitors, Ns5A inhibitors 

INTRODUCTION 

Hepatitis C virus (HCV) infection has rea - 

ched epidemic proportions, becoming a major 

global health issue. There are an estimated 170 

million chronic HCV carriers, comprising approximately 

3% of the global population [1] . 

Hepatitis C advances to a chronic state in up 

to 80% of people, which leads to liver cirrhosis 

in 20-40% of cases, with a significant risk of hepatic 

decompensation, hepatocellular carcinoma 

and need for liver transplantation in many countries. 

In the absence of active treatments, the 

number of patients with end-stage liver disease 

due to chronic HCV infection is expected to increase 

dramatically over the next decade [2]. 

The understanding of each step of HCV life 

cycle can lead to the development of specifically 

targeted antiviral therapy for hepatitis C (STAT- 

C), a strategy that has the potential to be more 

effective than the combination of pegylated interferon 

alpha and ribavirin used until now. 

HCV is a member of the Hepacivirus genus, 

Flaviviridae family. It is a small-enveloped virus 

with a single-stranded positive-sense RNA 

genome of approximately 9.6 kb that encodes 

three structural (core, E1, E2) and seven nonstructural 

(p7, NS2–NS5B) proteins. Short untranslated 

regions (UTRs) at each end of the 

genome (3’UTR and 5’UTR) are required for 

replication of the genome [3]. 

A series of recent developments allowed a 

better insight into the life cycle of HCV [4]: 

1. HCV RNA replication has been studied 

with the use of subgenomic/ genomic HCV 

replicons (full lengths or region of HCV RNA 

*Corresponding author: simona Ruþã, Ştefan s Nicolau Institute of Virology, 285, sos. Mihai Bravu, 030304, Bucharest, Romania, 

Telephone/fax: +40213242590, e-mail: simona@simonaruta.ro 

5

VAGU et al. 

molecule, that replicates autonomously from a 

single origin of replication) in human hepatoma 

cell line Huh7 [5]; 

2. Infectious HCV particles have been produced 

in cell culture using recombinant systems 

[6]; 

3. Large quantities of HCV-like particles 

have been yielded in insect cells with the use of 

modified baculovirus system [7]; 

4. Small animal models, consisting of genetically 

humanised mice, support at least partially 

HCV replication [8, 9]. 

VIRAL ENTRY AND POTENTIAL INHIBITORS 

HCV replication cycle began with viral attachment, 

followed by cell entry using initially 

a clathrin-mediated endocytosis mechanism and 

further fusion between the viral envelope and 

the endosomal membrane and uncoating of the 

HCV RNA genome. HCV envelope glycoproteins 

(E1 and E2) bind to a complex of receptors 

and coreceptors, that includes, but is not limited 

to: the CD81 tetraspanin, tight junction proteins 

claudin-1 and occludin, intercellular adhesion 

molecules like the dendritic cell-specific DC- 

SIGN/CD209 or the liver/lymph node-specific 

L-SIGN/CD209L and glycosaminoglycans [5, 

6]. Of note, several molecules involved in the 

lipoproteins cholesterol uptake are essential for 

this phase: scavenger receptor B type I (the principal 

High Density Lipoprotein receptor), lowdensity 

lipoprotein receptor, and the most 

recently identified - Niemann-Pick C1-like 1 receptor 

(NPC1L1) - expressed only on human 

and primate hepatocytes, that was suggested to 

participate in the removal of virion-associated 

cholesterol, generating conformational change 

to facilitate viral entry [10]. 

This link between the cholesterol metabolism 

and HCV life cycle suggests potential antiviral 

therapies directed to early steps of viral 

replication: 

An NPC1L1 antagonist called ezetimibe, 

that is FDA approved as a selective cholesterol 

absorption inhibitor, was proven to inhibit all 

HCV genotypes cell entry in vitro and to defer 

HCV genotype 1b infection in mice with human 

liver grafts [8]. 

A small molecule, provisionally named ITX 

5061, initially developed for inflammatory diseases, 

due to its action as a p38 MAP kinase inhibitor, 

and later associated to elevation of HDL 

levels in mice and human plasma, is studied in 

phase 1 clinical trials as an inhibitor of HCV 

replication at post-binding level. This compound 

targets the scavenger receptor BI and competes 

for HDL-mediated lipid transfer [11]. Using an 

in vitro system, ITX 5061 has proven to have 

additive or synergistic inhibitory antiviral acti - 

vity directed in combination with interferon-α, 

ribavirin, and HCV protease and polymerase inhibitors 

[12]. 

Inhibitions of host cell factors involved in 

this early stage of viral replication is a promising 

therapeutic option, that has been already proven 

to be effective in the case of HIV infection, with 

the use of maraviroc, an antagonist of the CCR5 

beta-chemokine coreceptor, used by macro - 

phage tropic HIV strains. In the case of HCV, it 

can be an extremely valuable choice for prevention 

of graft reinfection in patients with liver 

transplant. 

VIRAL REPLICATION AND DIRECT-ACTING 

ANTIVIRALS (DAA) 

The logarithmic growth phase consists of : 

1. direct translation of the positive-strand 

genomic RNA, that serves as messenger RNA, 

containing a single open reading frame (ORF) 

with synthesis of a single polyprotein of ≈3,000 

amino acids, the precursor of all HCV structural 

and nonstructural proteins. This step is initiated 

by the binding of the viral internal ribosome 

entry site (IRES) to the host ribosomal subunits 

[13]; 

2. post-translation processing of the large 

precursor polyprotein conducted by both cellular 

peptidases (signal peptidase and signal peptidepeptidase), 

and viral proteases encoded by the 

nonstructural proteins. NS2 is a zinc-dependent 

metalloprotease that cleaves the site between 

NS2 and NS3, while NS3/4A is a se rine-protease 

that catalyzes nonstructural HCV polyprotein 

cleavage dowstream of NS3 [14, 15]. 

3. nucleic acid replication conducted by the 

viral polymerase (NS5B), an RNA-dependent 

6

Understanding the molecular targets for new therapeutical agents in hepatitis C infection 

RNA polymerase (RdRp), a highly error-prone 

enzyme, that can introduce multiple mutations 

(with a rate of approximately 10 -3 per nucleotide 

per generation). Together with the high replication 

rate of HCV (10 10 to 10 12 virions per day, 

with a predicted viral half-life of 2 to 3 hours) 

[16], this explains the pronounced viral variabi - 

lity, accounting for the existence of at least 6 

major HCV genotypes (that differ by about 30% 

in their nucleotide and amino acid sequences) 

and a series of viral quasispecies. From this 

highly heterogenous viral population, the individual 

immune response selects escape mutants 

that persist in the host and account for the high 

rate of chronic HCV infections, while the direct 

acting antiviral drugs select resistant viral strains 

that explain the need for combination therapies. 

The final phase of the viral replicationcalled 

plateau - is initiated by the interaction of 

the core protein with HCV RNA genome, that 

determines a switch from replication to packaging. 

Virus particles are produced in the intracellular 

membranes derived from the endoplasmic 

reticulum or the Golgi compartment, and the 

newly produced virions are released by the secretory 

pathways of the host cell [17]. A major 

protein involved in both replication and virus assembly 

is the RNA-binding phosphoprotein encoded 

by the virus NS5A gene. Although this 

protein has no enzymatic activity, it exerts its 

role in the formation of the viral replication 

complex, possibly by recruiting a specific kinase 

(phosphatidylinositol 4-kinase, subtype IIIα- 

PI4KIIIα), to replication sites, stimulating its kinase 

activity, and generating local production of 

phosphatidylinositol phosphates [18, 19]. This, 

in turn, can recruit cellular factors, such as host 

cyclophilins A and B, imposing a trans to cis isomerization 

necessary for HCV replication. 

HCV RNA replication leads to rearrangements 

of intracellular membranes that are supposed to 

serve as scaffolds for the viral replication complex 

[19], forming a structure called the membranous 

web, rich in sterols [20]. 

NS3/4A PROTEASE INHIBITORS (PIS) 

Approved Protease inhibitors. In 2011, 

two orally administered drugs, Telaprevir (developed 

by Vertex Pharmaceuticals) and Boceprevir 

(developed by Schering Plough/Merck) were approved 

by both US Food and Drug Administration 

(FDA) and European Medicines Agency 

(EMA) for the treatment of HCV genotype 1 infection, 

in combination with pegylated interferon 

and ribavirin (PegIFN-RBV). The need for 

triple therapy derives from the early studies 

proving that monotherapy with both protease inhibitors 

promoted a rapid selection of drug-resistant 

viral strains preexisting at baseline in all 

HCV-infected patients [21, 22]. Both PIs are linear 

peptidomimetic ketoamide that act through 

covalent reversible binding of the serine active 

site of the NS3 protease, thus inhibiting the proteolytic 

cleavage of the viral precursor polypeptide 

in functional viral proteins [15]. Apart from 

their direct action on the viral replication cycle, 

the protease inhibitors can act by restoring the 

host innate response, as the HCV protease 

NS3/4A blocks IRF3 (a key transcriptional regulator 

of the IFN-response) and retinoid-inducible 

gene (RIG1-a growth regulator), leading 

to a reduction in the expression of IFN- signaling 

genes [23, 24]. 

Triple therapy is now the standard of care 

for patients infected with HCV genotype 1, as it 

increases the overall rate of therapeutical success 

both in previously naive patients and in 

former partial responders, relapsers and previously 

null responders [25, 26, 27] (Table 1). 

Telaprevir (Incivek/Incivo TM ) is administered 

orally (750 mg, two 375-mg tablets, taken 3 

times a day) for 12 weeks in combination with 

PegIFN-RBV. Treatment is continued with dual 

therapy (PegIFN-RBV) for an additional period 

of 12 weeks if HCV-RNA levels at weeks 4 and 

12 are undetectable or for an aditional period of 

36 weeks if HCV RNA is detectable (1000 

IU/mL or less) at Weeks 4 and/or 12 [33]. Boceprevir 

(Victrelis TM ) is administered orally (800 

mg three times per day with food) in triple combination 

therapy for 24-44 weeks only after a 4 

weeks lead-in phase with PegIFN-RBV alone. 

The aim of the lead- in phase is to reduce viral 

replication and further emergence of resistant 

variants; it also allows identification of patients 

with a rapid virological response (RVR: undetectable 

HCV RNA after 4 weeks of treatment), 

7

VAGU et al. 

c 

Table 1. Phase 3 trials with triple therapy: PIs (telaprevir or boceprevir) 

combined with peginterferon alfa-2a and ribavirin (PegIFN-RBV) 

Clinical study Patients/no. Duration of treatment Aim and Results 

ADVANCE 

(telaprevir-TVR) 

[28] 

ILLUMINATE 

(telaprevir) 

[29] 

REALISE 

(telaprevir) 

[30] 

SPRINT 2 

(boceprevir) 

[31] 

RESPOND-2 

(boceprevir) 

[32] 

treatment-naïve 

1088 

treatment-naïve 

540 

prior treatment 

failures 

633 

treatment naive, 

1097 

treatment failures, 

403 

9 or 12 wks of triple therapy, 

then 12 or 36 wks PegIFN-RBV 

alone 

RGT:-triple therapy for 12 wks, 

then 12 or 24 wks of PegIFN- 

RBV alone 

triple therapy for 12 wks, 

followed by PegIFN-RBV alone 

for 36 wks. 

Lead-in period (4 wks PegIFN- 

RBV), then triple therapy 24/44 

wks 

Lead-in period (4 wks PegIFN- 

RBV), then triple therapy 32/ 44 

wks 

79% SVR rate after 12 weeks of 

triple therapy vs 46% for 

PegIFN- RBV alone 

92% SVR rate in patients with 

eRVR treated for 24 wks vs 88% 

in those treated for 48 wks 

SVR rates for prior relapsers: 

86% vs 22%; for prior partial 

responders: 59% vs 15% and for 

prior null responders: 32% vs 5% 

63–66% SVR rates vs 38% in the 

control group 

59-66% SVR rates in prior partial 

responders and relapsers vs. 21% 

in the control group 

a) eRVR (extended rapid virologic response) - undetectable HCV RNA levels at wks 4 and 12; 

b) RGT - Response-guided therapy 

who have high chances of achieving sustained 

virological response (SVR) without protease inhibitors 

addition [22, 34]. Futility rules (indicating 

the need for treatment discontinuation if 

viral load remains detectable, at 4 and 12 weeks) 

have been established for both available protease 

inhibitors [33, 34]. 

For patients infected with HCV genotypes 

2 or 3, the standard of care remains treatment 

with pegylated interferon alfa plus ribavirin, that 

achieves important sustained virological response 

rates (80% vs less than 60% in those with HCV 

genotype 1 infection), with a shorter duration of 

therapy (24 vs 48 weeks) [35]. 

Other investigational first generation protease 

inhibitors are in advanced phases of clinical 

trials. The aim is to obtain drugs with 

superior efficacy and more favourable pharmacokinetic 

parameters in order to allow once or 

twice daily administration and a shortened duration 

of therapy. All these first generation PIs 

exhibit class-cross resistance, with emergence 

of drug resistant mutation in all cases of virologic 

breakthrough. Second-generation protease 

inhibitors, mostly non-covalent inhibitors of the 

NS3/4A, are under development. They exibit 

pan-genotypic activity and have different mutational 

profiles and higher barriers to resistance 

than first-generation PIs (Table 2). 

NS5B POLYMERASE INHIBITORS 

The NS5B encoded RNA-dependent RNA 

polymerase (RdRP) is similar in structure to the 

HIV reverse transcriptase, with the catalytic domain 

containing 531 residues folded in the conformation 

of a right hand with fingers and 

fingertips and separate domains forming the 

palm and thumb [45]. Accordingly, the polymerase 

inhibitors are designed following the 

model of the two active classes of HIV reverse 

transcriptase inhibitors: 

Nucleos(t)ide analogues compete with cellular 

nucleos(t)ides, acting as chain terminators 

and stopping the viral RNA elongation, giving 

rise to less replication-fit variants. Due to the 

highly conserved nature of the viral polymerase, 

these compounds are expected to be active 

across all HCV genotypes and subtypes. Although 

their antiviral efficacy is lower than that 

of protease inhibitors, they have a high barrier 

to resistance. These compounds have advanced 

to phase II trials (Table 3). 

Non-nucleos(t)ide inhibitors act via allosteric 

inhibition of the NS5B RdRP catalytic 

site, inducing conformational changes in the enzyme 

and reducing its activity. The presence of 

at least four different sites to which a non-nucleoside 

molecule could bind and cause inhibition 

(vs a single one in HIV RT), allow the 

8


Name/ 

Manufacturer 

Simeprevir (TMC435) 

Tibotec Pharmaceutical 

[36] 

BI201335/ 

Boehringer Ingelheim 

Pharma 

[37] 

Asunaprevir 

(BMS 650032)/ 

Bristol-Myers Squibb 

[38] 

Danoprevir 

(ITMN191/RG7227)/ 

Roche 

[39, 40] 

Vaniprevir (MK-7009)/ 

Merck & Co. 

[41] 

MK-5172/ 

Merck & Co. 

[42] 

ABT-450/ritonavir 

Abbott and Enanta 

[43] 

ACH-1625 

[44] 

Table 2. Second-generation of protease inhibitors 

Activity 

Multiple genotypes 

(except genotype 3) 

Clinical trial 

phase 

III (ongoing) 

Previous results 

SVR rates: 85% for relapsers, 75% for 

partial responders and 51% for null 

responders in IIb trials 

Multiple genotypes III (ongoing) SVR rates: 71-83% in treatment-naïve 

and 28-41% in treatment-experienced 

patients 

Genotypes 1 and 4 IIa/IIb High EVR and SVR (80%) rates after 

48 wks of treatment with triple therapy 

irrespective of IL28B genotype 

Genotypes 1, 4 and 6 IIb SVR rates: 67- 93% in genotype 1 and 

100% in genotype 4, treatment-naive, 

non-cirrhotic adults. Better antiviral 

activity if boosted with ritonavir. 

Genotypes 1 and 2 IIb 74-85% response at wk 12 vs 67-84% at 

week 4 in treatment naïve patients 

All genotypes, except 

genotype 3 

II 

Viral load reduction with 4-5 log 10 in 

patients infected with either genotype 1 

or 3. Active against most variants 

resistant to first-generation protease 

inhibitors 

Genotype 1 IIa Complete early virological response at 

wk 12 in 92% treatment-naive, 

genotype 1 infected patients after 

3 days of monotherapy, followed by 

12 weeks of triple therapy then SOC 

alone for week 48 wks 

All genotypes, except 

genotype 3 

IIa 

Rapid viral response in 75-81% patients 

with triple therapy vs 20% in those 

receiving SOC only 

a) SVR - sustained virologic response; b) EVR - early virologic response, c) SOC - standard of care- pegylated 

interferon plus ribavirin 

design of drugs without cross-resistance. These 

compounds have a lower antiviral activity, a low 

barrier to resistance and are active only against 

HCV genotypes 1a and 1b. Therefore, their use 

could be limited to combination with other 

DAAs (Table 4). 

POTENTIAL INHIBITORS OF VIRUS ASSEMBLY 

NS5A Inhibitors. Daclatasvir (BMS 

790052), an NS5A replication complex inhibitor, 

active on genotypes 1 and 4, is currently 

in phase 3 clinical trial in combination with 

SOC. The drug may be administered once-daily 

and determines a rapid decline in HCV viral 

load [55]. 

Phase 1b studies for NS5A nucleotide inhibitors, 

such as PPI 461 (with pan- genotypes 

activity) and GSK2336805 (active on genotypes 

1a, 1b, 2a and 4), are also ongoing [56]. 

Cyclophilin analogues. Host cyclophilins 

are important factors involved in protein folding. 

Cyclophilin inhibitors block the interaction 

of cyclophilins with HCV NS5A, thus preventing 

the development of a functional viral replication 

complex. Alisporivir (Debio-025) is a 

non-immunosuppressive cyclosporin analog, 

that has important antiviral activity in both HCV 

monoinfected and HIV/HCV coinfected patients. 

After 28 days of administion, combined 

9

VAGU et al. 

Table 3. Nucleotide Polymerase Inhibitors-NPI 

Name/ Manufacturer 

R7128/ 

Roche & Pharmasset 

[46] 

Mericitabine 

(RG7128)/ Gilead 

[47] 

PSI-7977/ Pharmasset, 

Inc, Sofosbuvir 

[48] 

Activity 

Clinical trial 

phase 

Previous results 

Multiple genotypes IIb 88% of treatment naïve patients infected with 

genotype 2 or 3 and 90% of nonresponders 

RVR 

All genotypes IIb High rates of RVR and cEVR in treatmentnaive 

patients with genotype 1 or 4 HCV 

infection 

Genotypes 1, 2, 3 IIb SVR in 98% treatment naïve patients infected 

with genotype 1. A pilot study showed high 

rates of SVR also in those with genotypes 2 or 

3 

INX-08189/BMS- 

986094/ 


[49] 

Genotypes 1, 2, 3 IIb The phase IIb trial was suspended in August, 

2012, after a case of heart failure 

a) RVR - rapid virologic response; b) cEVR - complete early virologic response, c) SVR - sustained virologic 

response; d) SOC- standard of care- pegylated interferon plus ribavirin 

with PegIFN-alpha2a, it determined significant 

viral load reduction in patients infected with 

genotypes 1, 3 and 4 [57]. 

FUTURE DIRECTIONS 

Combinations of Direct Acting Antivirals 

with Different Mechanisms of Action. 

By analogy with the HAART (highly active 

antiretroviral therapy) regimens available for 

HIV infection, that associate drugs from different 

classes, combinations of potent DAAs with 

divergent mechanism of actions are tested in 

chronically HCV infected patients. Drugs with 

different mechanisms of action will be an attractive 

strategy for hepatitis C. Due to the fact that 

HCV replication occurs entirely intracytoplasmic 

and is limited to hepatocytes, without any 

extracellular reservoirs (unlike the proviral DNA 

Name/ 

Manufacturer 

BI207127/ 


[50] 

Filibuvir/ Pfizer 

[51] 

ABT 072/Abbott 

[52] 

ANA598 (Setrobuvir)/ 

Anadys 

[53] 

ABT 333/ 

Abbott 

[52] 

GS9190/ 

Gilead 

[54] 

10 

Activity 

Table 4. Results of clinical trials of NNPI 

Clinical 

trial phase 

Previous 

results 

Genotype 1 IIa EVR rates of 92.3% in treatment naive and of 

20% in treatment experienced patients 

Genotype 1 IIb Response rates of 60-70% at week 48, but 20- 

50% relapsed by week 60 

Genotype 1 IIa EVR in 70% cases after 12 wks of triple 

therapy 

Genotype 1 IIb EVR in 73% cases after 12 wks of triple 

therapy 

Genotype 1 IIa EVR in 75% cases after 12 wks of triple 

therapy 

Genotype 1 IIb Increased EVR rates, but no increase in SVR 

rate compared to SOC alone after 24-48 wks of 

triple therapy 

a) EVR - early virologic response; b) SVR - sustained virologic response; c) SOC - standard of care- pegylated 

interferon plus ribavirin


Table 5. Current DAA w combination therapies with or without PEG-IFN/RBV in clinical development 

COMBINATION/ 

Manufacturer 

NS3 Protease Inhibitor 

(Danoprevir/ritonavir-boosted)+ 

NS5B Nucleoside Inhibitor 

(RG7128)/ 

Hoffmann-LaRoche/ Genentech 

[60] 

RBV or PegIFN- 

RBV 

No 

DAAs alone 

Patients 

Treatment Naïve 

+ Experienced 

Comments 

HCV RNA decreased with 

5.1 log10 in treatmentnaive 

patients and with 

4·9 log10 in previous null 

responders 

NS3 Protease Inhibitor (Telaprevir)+ 

NS5B Non-Nucleoside Inhibitor 

(VX-222)/ 

Vertex Pharmaceuticals 

[61] 


(BMS-650032)+ 

NS5A Inhibitor (BMS-790052)/ 


[62] 


(BI 201335) + 

NS5B Non-Nucleoside. Inhibitor 

(BI207127)/ Boehringer Ingelheim 

[63] 


(ABT-450/r) + 

NS5B Non-Nucleoside Inhibitor 

(ABT072)/ 

Abbot Laboratories 

[64] 

NS5B Nucleoside Inhibitors 

(PSI-7977 + PSI-938) / Pharmasset 

[65] 

Association with 

PegIFN/RBV 

Both DAAs alone 

and associated with 

PegIFN/RBV 


RBV 


RBV 

Treatment Naive 

Prior nullresponders 



82-93% SVR rates after 

12 weeks of treatment 

(depending on the DAAs 

doses) 

cEVR achieved in 5/11 

patients treated with DAA 

combination and in 9/10 

patients treated with DAA 

and pegIFN/RBV 

100% RVR in patients 

treated with the highest 

doses 

EVR in 91% of patients 

with IL28B CC genotype, 

82% had undetectable 

HCV RNA after 36 weeks 

DAAs alone Treatment Naive Safe and well tolerated 

over 714 days 

a) SVR - sustained virologic response; b) cEVR - complete early virologic response, c) RVR- rapid virologic response 

integrated in PBMCs for HIV or the cccDNA integrated 

in hepatocytes for HBV), it seems possible 

that chronic hepatitis C will become the 

first chronic infection to be cured. Based on the 

estimated total body viral burden of 10 11 virions 

and on the proposed model of 2 phases of viral 

clearance (with a sharp decline of 3.5 log 10 in 

the first 36 hours, followed by clearance of free 

virions and subsequent loss of infected hepatocytes) 

it was proposed that triple therapy with 

DAAs will conduct to HCV eradication in 8-12 

weeks [58]. Future treatment directions [59] 

focus on: 

Quadruple therapy, based on the addition 

of two DAA agents from different classes to 

PegIFN-RBV, that may prove to be particularly 

useful for HCV relapsers and partial/null responders. 

Interferon-free combinations, based on 

the use of two DAAs with a high barrier to resistance, 

with or without RBV, that will probably 

be reserved for patients with intolerance or 

with contraindications to IFN/RBV or for those 

with very low response rates (decompensated 

cirrhosis, recurrence following solid organ 

transplantation, null-responders). It seems probable 

that RBV will still be required, due to its 

antiviral activity, and its contribution to the virologic 

success, both in terms of acquiring and 

maintaining the sustained response and lower 

the relapse rate. An overview of current trials is 

given in Table 5. 

CONCLUSIONS 

Intimate knowledge of the HCV life cycle 

allowed the development of a series of novel 

11

VAGU et al. 

anti-HCV agents (both direct-acting antivirals- 

DAAs and agents that target host-specific molecules), 

with the aim of augmenting the efficacy 

of SOC therapy. Although triple therapy with a 

protease inhibitor and PEG-IFN/RBV will likely 

remain the standard of care for patients with 

genotype 1 chronic HCV infection, several second 

generation protease inhibitors and NS5A 

inhibitors are in advanced phases of clincal studies, 

with very promising results. Meanwhile, 

combinations of DAAs with or without IFN and 

RBV are being tested as alternatives, with 

watchfulness towards the potential development 

of multidrug resistance. 

ACKNOWLEDGEMENTS 

SULTANA CAMELIA was supported by 

the Sectoral Operational Programme Human 

Resources Development (SOP HRD), financed 

from the European Social Fund and by the Romanian 

Government under the contract number 

POSDRU/89/1.5/S/64109. 

REFERENCES 

1. National Institutes of Health Consensus Development 

Conference Statement: Management of hepatitis C. 

Gastroenterology 2002. 123(6): 2082-2099. 

2. Deuffic-Burban S, Poynard T, Sulkowski MS, Wong 

JB. Estimating the future health burden of chronic hepatitis 

C and human immunodeficiency virus infections 

in the United States. J Viral Hepat 2007.14:107-115. 

3. Choo QL, Richman KH, Han JH, Berger K, Lee C, 

Dong C, Gallegos C, Coit D, Medina-Selby R, Barr 

PJ. Genetic organization and diversity of the hepatitis 

C virus. Proc Natl Acad Sci USA 1991. 88:2451-2455. 

4. Rice CM. New insights into HCV replication: potential 

antiviral targets. Top Antivir Med 2011.19:117–120. 

5. Blight KJ, McKeating JA, Rice CM. Highly permissive 

cell lines for subgenomic and genomic hepatitis C 

virus RNA replication. J Virol 2002.76:13001-13014. 

6. Wakita T, Pietschmann T, Kato T, Date T, Miyamoto 

M, Zhao Z, Murthy K. Production of infectious he - 

patitis C virus in tissue culture from a cloned viral 

genome. Nat Med 2005.11:791-796. 

7. Yu X, Qiao M, Atanasov I, Hu Z, Kato T, Liang TJ, 

Zhou ZH. Cryo-electron microscopy and three-dimensional 

reconstructions of hepatitis C virus particles. Virology 

2007. 367:126-34. 

8. Dorner M, Horwitz JA, Robbins JB, Barry WT, 

Feng Q, Mu K. A genetically humanized mouse model 

for hepatitis C virus infection. Nature 2011. 474:208- 

211. 

9. Washburn ML, Bility MT, Zhang L, Kovalev GI, 

Buntzman A, Frelinger JA, Barry W, Ploss A, Rice 

CM, Su L. A humanized mouse model to study hepatitis 

C virus infection, immune response, and liver disease. 

Gastroenterology 2011. 140:1334-1344. 

10. Sainz B Jr, Barretto N, Martin DN, Hiraga N, Imamura 

M, Hussain S, Marsh KA, Yu X, Chayama 

K, Alrefai WA, Uprichard SL. Identification of the 

Niemann-Pick C1-like 1 cholesterol absorption receptor 

as a new hepatitis C virus entry factor. Nat Med 

2012. 18(2):281-285. 

11. Syder AJ, Lee H, Zeisel MB, Grove J, Soulier E, 

Macdonald J, Chow S, Chang J, Baumert TF, 

McKeating JA, McKelvy J, Wong-Staal F. Small 

molecule scavenger receptor BI antagonists are potent 

HCV entry inhibitors. J Hepatol 2011. 54(1):48-55. 

12. Zhu H, Wong-Staal F, Lee H, Syder A, McKelvy J, 

Schooley RT, Wyles DL. Evaluation of ITX 5061, a 

Scavenger Receptor B1 Antagonist: Resistance Selection 

and Activity in Combination With Other Hepatitis 

C Virus. Antivirals J Infect Dis 2012. 205(4): 656-662. 

13. Otto GA, Puglisi JD. The pathway of HCV IRESmediated 

translation initiation. Cell 2004. 119:369– 

380. 

14. Lorenz IC, Marcotrigiano J, Dentzer TG, Rice 

CM. Structure of the catalytic domain of the hepatitis 

C virus NS2-3 protease. Nature 2006. 442:831–835. 

15. Bartenschlager R, Lohmann V, Wilkinson T, 

Koch JO. Complex formation between the NS3 serine-type 

proteinase of the hepatitis C virus and NS4A 

and its importance for polyprotein maturation. J Virol 

1995. 69:7519–7528. 

16. Neumann AU, Lam NP, Dahari H, Gretch DR, 

Wiley TE, Layden TJ, Perelson AS. Hepatitis C viral 

dynamics in vivo and the antiviral efficacy of interferon-alpha 

therapy, Science 1998. 282(5386):103- 

107. 

17. Vauloup-Fellous C, Pene V, Garaud-Aunis J, 

Harper F, Bardin S, Suire Y. Signal peptide peptidase-catalyzed 

cleavage of hepatitis C virus core protein 

is dispensable for virus budding but destabilizes 

the viral capsid. J Biol Chem 2006. 281:27679–27692 

18. Gao M, Nettles RE, Belema M, Snyder LB, Nguyen 

VN, Fridell RA, Serrano-Wu MH, Langley DR, 

Sun JH, O’Boyle DR. Chemical genetics strategy 

identifies an HCV NS5A inhibitor with a potent clinical 

effect. Nature 2010. 465: 96–100. 

19. Moradpour D, Penin F, Rice CM Replication of hepatitis 

C virus. Nat Rev Microbiol 2007. 5: 453–463. 

20. Reiss S, Rebhan I, Backes I, Romero-Brey I, Erfl 

H, Matula P, Kaderali L, Poenisch M, Blankenburg 

H, et al. Recruitment and activation of a lipid kinase 

by hepatitis C virus NS5A is essential for 

integrity of the membranous replication compartment. 

Cell Host & Microbe 2011. 9(1):32-45. 

21. Sarrazin C, Kieffer TL, Bartels D, Hanzelka B, 

Muh U, Welker M. Dynamic hepatitis C virus genotypic 

and phenotypic changes in patients treated with 

the protease inhibitor telaprevir. Gastroenterology 

2007.132:1767–1777. 

22. Susser S, Welsch C, Wang Y, Zettler M, Domingues 

FS, Karey U, Hughes E, Ralston R. Characterization 

of resistance to the protease inhibitor boceprevir in 

hepatitis C virus-infected patients. Hepatology 2009. 

12


50:1709–1718. 

23. Gale MJr, Korth MJ, Katze MG. Repression of the 

PKR protein kinase by the hepatitis C virus NS5A protein: 

a potential mechanism of interferon resistance. 

Clinical and Diagnostic Virology 1998. 10 (2-3):157– 

162. 

24. Johnson C, Owen D, and Gale MJr. Functional and 

therapeutic analysis of hepatitis C virus NS3/4A protease 

control of antiviral immune defense. Journal of 

Biological Chemistry 2007. 282 (14): 10792–10803. 

25. Pearlman L. Protease inhibitors for the treatment of 

chronic hepatitis C genotype-1 infection: the new standard 

of care–review. The Lancet Infectious Diseases 

2012. 12(9):717-728. 

26. Bacon BR, Gordon SC, Lawitz E, Marcellin P. Boceprevir 

for previously treated chronic HCV genotype 

1 infection. N Engl J Med 2011. 364:1207-1217. 

27. Zeuzem S, Andreone P, Pol S, Lawitz E. Telaprevir 

for retreatment of HCV infection. N Engl J Med 2011. 

364:2417-2428. 

28. Jacobson IM, McHutchison JG, Dusheiko G. 

Telaprevir for previously untreated chronic hepatitis 

C virus infection. N Engl J Med 2011. 364:2405- 

2416. 

29. Sherman KE, Flamm SL, Afdhal NH, Nelson DR, 

Sulkowski MS, Everson GT. Response-guided 

telaprevir combination treatment for hepatitis C virus 

infection. N Engl J Med 2011. 365: 1014-1024. 

30. Foster GR, Zeuzem S, Andreone P, Pol S, Lawitz 

EJ, Diago M, Roberts S. et al Subanalyses of the 

telaprevir lead-in arm in the REALIZE study: response 

at week 4 is not a substitute for prior null response 

categorization. J Hepatol 2011. 54, S3-S4. 

31. Poordad F, McCone J. Jr, Bacon BR, Bruno S, 

Manns MP, Sulkowski MS. Boceprevir for untreated 

chronic HCV genotype 1 infection. N Engl J Med 

2011. 364:1195–1206 

32. Bacon BR, Gordon SC, Lawitz E. HCV RESPOND- 

2 final results: high sustained virologic response 

among genotype 1 previous nonresponders and relapsers 

to peginterferon/ribavirin when re-treated with 

boceprevir plus pegintron (peginterferon alfa-2b)/ribavirin. 

Hepatology 2010. 52: 430A. 

33. US Food and Drug Administration. Approval of Incivek 

(telaprevir), a direct acting antiviral drug (DAA) 

to treat hepatitis C (HCV). Available from: 

http://www.fda.gov/ForConsumers/ByAudience/For- 

PatientAdvocates/ucm256328.htm 

34. US Food and Drug Administration. Approval of Victrelis 

(boceprevir), a direct acting antiviral drug 

(DAA) to treat hepatitis C virus (HCV). Available 

from: http://www.fda.gov/ForConsumers/ByAudience/ForPatientAdvocates/ 

ucm255413.htm 

35. Zeuzem S, Berg T, Moeller B, Hinrichsen H, Mauss 

S, Wedemeyer H, Sarrazin C, et al. Expert opinion 

on the treatment of patients with chronic hepatitis C. 

J Viral Hepat 2009. 16(2): 75–90. 

36. Marcellin P, Reesink H, Berg T, Cramp M, Flisiak 

R, Van Vlierberghe H, Verloes R, Lenz O, Peeters 

M, Sekar V, De Smedt G. Antiviral activity and 

safety of TMC435 combined with peginterferon a-2a 

and ribavirin in patients with genotype-1 hepatitis C 

infection who failed previous IFN-based therapy. J 

Hepatol 2009. 50: S 385 

37. Sulkowski MS, Bouliere M, Bronowicki J-P, 

Streinu-Cercel A, Preotescu L, Asselah T, et al. 

SILEN-C2: sustained virologic response (SVR) and 

safety of BI201335 combined with peginterferon alfa- 

2a and ribavirin (P/R) in chronic HCV genotype-1 patients 

with non-response to P/R J Hepatol 2011, 54: S30 

38. Bronowicki J-P, Pol S, Thuluvath P. Asunaprevir 

(ASV; BMS-650032), an NS3 protease inhibitor, in 

combination with peginterferon and ribavirin in treatment-naive 

patients with genotype 1 chronic hepatitis 

C infection). J Hepatol 2011. 54: S472. 

39. Everson G, Cooper C, Hézode C, Shiffman ML, 

Yoshida E, Beltran-Jaramillo T, Ferenci P. Rapid 

and sustained achievement of undetectable HCV RNA 

during treatment with ritonavir-boosted danoprevir/ 

Peg-IFNα-2A/RBV in HCV genotype 1 or 4 patients: 

DAUPHINE week 12 interim analysis. The EASL International 

Liver Congress 2012, Barcelona April 18- 

22, 2012 

40. Gane E, Rouzier R, Stedman C, Wiercinska-Drapalo 

E, Horban A, Chang L, Zhang Y. Ritonavir 

boosting of low dose RG7227/ITMN-191, HCV 

NS3/4A protease inhibitor, results in robust reduction 

in HCV RNA at lower exposures than provided by unboosted 

regimens. J Hepatol 2010. 52: S16-S17 

41. Manns M, Lee A. Sustained viral response (SVR) 

rates in genotype 1 treatment-naïve patients with 

chronic hepatitis C (CHC) infection treated with vaniprevir 

(MK-7009), a NS3/4a protease inhibitor, in 

combination with pegylated interferon alfa-2a and ribavirin 

for 28 days. http://www.natap.org/2010/ 

AASLD/AASLD_24.htm 

42. S. Ludmerer, N. Liverton, J. McCauleya. Discovery 

of MK-5172 a next generation HCV NS3/4a protease 

inhibitor: raising the bar of this important class of molecules, 

International Conference on Viral Hepatitis 

2012, New York, March 26-27, 2012. Abstract 79328. 

43. Lawitz E, Gaultier I, Poordad F, Cohen DE, 

Menon R, Larsen LM. 1220 ABT-450/ritonavir 

(ABT-450/R) combined with pegylated interferon 

alpha-2A and ribavirin (SOC) after 3-day monotherapy 

in Genotype 1 HCV-infected treatment-naive subjects: 

12-week interim efficacy and safety results. J 

Hepatol 2011. 54: S482. 

44. Lalezari J, Hazan L, Kankam M, Lawitz E. High 

rapid virologic response (RVR) with ACH-1625 daily 

dosing plus pegIFN-Alpha 2A/RBV in a 28-day phase 

2A trial. 62nd Annual Meeting of the American Association 

for the Study of Liver Diseases. San Francisco, 

Nov 6-9, 2011. Abstract 1341. 

45. Bressanelli S, Tomei L, Roussel A, Incitti I, Vitale 

RL, Mathieu M, De Francesco R, Rey FA. Crystal 

structure of the RNA-dependent RNA polymerase of 

hepatitis C virus, PNAS 1999. 96 (23): 13034–13039. 

46. Gane EJ, Rodriguez-Torres M, Nelson DR. Antiviral 

activity of the HCV nucleoside polymerase inhibitor 

R7128 in HCV genotype 2 and 3 prior 

non-responders: interim results of R7128 1500mg 

BID with PEG-IFN and ribavirin for 28 days. Hepatology 

2008. 48: ALB10. 

13

VAGU et al. 

47. Jensen DM, Wedemeyer H, Herring RW, Ferenci 

P, Ma MM, Zeuzem S, Rodriguez-Torres M, et al. 

High rates of early viral response, promising safety 

profile and lack resistance-related breakthrough in 

HCV GT1/4 patients treated with RG7128 plus 

pegIFN alfa-2a (40KD)/RBV: planned week 12 interim 

analysis from the PROPEL study. 61st Annual 

Meeting of the American Association for the Study of 

Liver Diseases. Boston, October 29 - November 2, 

2010, Abstract 81. 

48. Lawitz E, Lalezari JP, Hassanein T, et al. Oncedaily 

PSI-7977 plus Peg/RBV in treatment-naïve patients 

with HCV GT1: robust end of treatment 

response rates are sustained post-treatment. Hepatology 

2011. 54 (suppl 1):225. 

49. U.S. National Institutes of Health. ClinicalTrial.gov, 

Phase 2b study of BMS-986094 and daclatasvir, with 

or without ribavirin for the treatment of patients with 

chronic hepatitis C, available from http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01629732 

50. Larrey D, Levin J, Lohse A, de Ledinghen V, Trepo 

C, Gerlach T. 4 week therapy with the non-nucleosidic 

polymerase inhibitor BI 207127 in combination 

with peginterferon alfa2A and ribavirin in treatment 

naïve and treatment experienced chronic HCV GT1 

patients. Journal of Hepatology 2010. 52 (suppl 1): 

S466 

51. Jacobson IM, Pockros PJ, Lalezari J, Lawitz E, 

Rodriguez-Torres M, et al. Virologic response rates 

following 4 weeks of filibuvir in combination with pegylated 

interferon alfa-2a and ribavirin in chronically 

infected HCV genotype 1 patients. J Hepatol 2010. 52 

(suppl 1): S465 

52. Middleton T, He Y, Beyer J. Factors affecting HCV 

viral load response to the non-nucleoside polymerase 

inhibitors ABT-072 and ABT-033. J Hepatol 2011, 54 

(suppl 1): S483-S484. 

53. National AIDS Treatment Advocacy Project Organisation 

(NATAP). ANA-598 HCV non-nuke Phase 2b 

study preliminary data results, 2011. Available from: 

http://www.natap.org/2011/HCV/101411_01.htm. 

54. U.S. National Institutes of Health-ClinicalTrial.gov. 

Efficacy and safety study of GS-9256 and GS-9190 

Alone and in Combination With Ribavirin for 28 Days 

in Patients With Chronic Hepatitis C Virus Infection. 

Available from: http://clinicaltrials.gov/ct2/show/ 

NCT01072695 

55. Nettles R, Chien C, Chung E, Persson A, Gao M, 

Belema M. BMS-790052 is a first-in-class potent hepatitis 

C virus (HCV) NS5A inhibitor for patients with 

chronic HCV infection: Results from a proof-of-concept 

study. Hepatology 2008. 48(suppl): LB12–LB12. 

56. Lalezari JP, Agarwal K, Dusheiko G. Dose-ranging 

trial of PPI- 461, a potent new pan-genotypic HCV 

NS5A inhibitor, in patients with HCV genotype-1 infection. 

Hepatology 2011. 54:400A. 

57. Flisiak R, Feinman SV, Jablkowski M. The cyclophilin 

inhibitor Debio 025 combined with PEG- 

IFN alpha2a significantly reduces viral load in 

treatment naive hepatitis C patients. Hepatology 2009. 

49:1460-1468. 

58. Ohara E, Hiraga N, Imamura M, et al. Elimination 

of hepatitis C virus by short term NS3-4A and NS5B 

inhibitor combination therapy in human hepatocyte 

chimeric mice. J Hepatol 2011. 54: 872–878. 

59. Zeuzem S, Buggisch P, Agarwal K. Dual, triple, and 

quadruple combination treatment with a protease inhibitor 

(GS-9256) and a polymerase inhibitor (GS- 

9190) alone and in combination with ribavirin (RBV) 

or PegIFN/RBV for up to 28 days in treatment-naive, 

genotype 1 HCV subjects. The 61st Annual Meeting 

of the American Association for the Study of Liver 

Diseases. Boston, October 29 - November 2, 2010, 

Abstract LB-1. 

60. Gane EJ, Roberts SK, Stedman CA. Oral combination 

therapy with a nucleoside polymerase inhibitor 

(RG7128) and danoprevir for chronic hepatitis C 

genotype 1 infection (INFORM-1): a randomised, 

double-blind, placebo-controlled, dose- escalation 

trial. Lancet 2010. 376:1467-1475. 

61. Nelson DR, Gane EJ, Jacobson IM, Di Bisceglie 

AM, Alves K, Koziel MJ. VX-222/Telaprevir in combination 

with peginterferon-alfa-2a and ribavirin intreatment-naive 

genotype 1 HCV patients treated for 

12 weeks: Zenith study, SVR 12 interim analyses. Hepatology 

2011. 54:1442. 

62. Lok AS, Gardiner DF, Lawitz E. Combination therapy 

with BMS-790052 and BMS-650032 alone or 

with PEGIFN/RBV results in undetectable HCV RNA 

through 12 weeks of therapy in HCV genotype 1 null 

responders. Hepatology 2010. 52:877A. 

63. Zeuzem S, Asselah T, Angus PW. Strong antiviral 

activity and safety of IFN-sparing treatment with the 

protease inhibitor BI 201335, the HCV polymerase inhibitor 

BI 207127 and ribavirin in patients with 

chronic hepatitis C. Hepatology 2010, 52:876A. 

64. Lawitz E, Poordad F, Kowdley KV. A 12-week interferon-free 

regimen of ABT-450/r, ABT-072, and 

ribavirin was well tolerated and achieved sustained virologic 

response in 91% treatment-naïve HCV IL28B- 

CC genotype-1-infected subjects. EASL International 

Liver Congress 2012, Barcelona April 18-22, 2012. 

Abstract 13. 

65. Lawitz E, Rodriguez-Torres M, Denning J. Once 

daily dual nucleotide combination of PSI-938 and PSI- 

7977 provides 94% HCV RNA

AGeNÞI TeRAPeUTICI CU ACÞIUNe DIReCTÃ ANTIVIRALÃ 

ÎN INFeCÞIA CU VIRUs HePATITIC C - NOI ÞINTe MOLeCULARe 

Codruþa Vagu 1 , Camelia Sultana 1,2 , Simona Ruþã 1,2 * 

¹Universitatea de medicinã şi Farmacie Carol davila, bucureşti, România 

² institutul de virusologie Ştefan s. nicolau, bucureşti, România 

ReZUMAT 

Inţelegerea mecanismelor care stau la baza replicării virusului hepatitic C (VHC) au condus la identificarea 

unor noi ţinte moleculare şi la dezvoltarea unor compuşi terapeutici cu acţiune directă antivirală 

(direct acting antivirals - DAA), aflaţi în studii clinice de fază avansată. Aceştia acţionează 

direct asupra proteinelor VHC: proteaza NS3-4A (implicată în prelucrarea post-traducere a proteinelor 

virale), NS5B (ARN-polimeraza ARN-dependentă ce catalizează replicarea genomului viral) şi NS5A 

(cu rol atât în formarea complexului replicativ, cât şi în asamblarea virală). Sunt în studiu, de asemenea, 

agenţi terapeutici care țintesc proteine ale gazdei implicate fie în fazele timpurii ale replicării virale 

(inhibitori ai receptorilor sau coreceptorilor), fie în momentul formării complexului replicativ (inhibitorii 

ciclofilinelor). 

Recent au fost aprobaţi şi introduşi în practică 2 inhibitori de protează NS3-4A (telaprevir şi boceprevir), 

administraţi în asociere cu interferonul pegylat şi ribavirina pentru tratarea pacienţilor infectaţi 

cu genotipul 1 al VHC. Tripla combinaţie determină o creştere semnificativă a ratei de răspuns virusologic 

susţinut (66-75% în cazul pacienţilor anterior naivi terapeutic şi 59-66% în cazul celor cu eşec 

terapeutic anterior). 

Ultimele studii clinice raportează alternative valoroase de creştere a eficienţei terapeutice utilizând: 

inhibitorii de protează de generaţia a doua, inhibitorii ARN - polimerazei NS5B (analogii nucleozidici 

şi non-nucleozidici) şi inhibitorii NS5A. 

O nouă direcţie de cercetare este reprezentată de evaluarea eficienţei combinaţiilor de agenţi antivirali 

din diferite clase terapeutice, cu scopul de a limita apariţia variantelor virale rezistente şi de a eradica 

infecţia VHC. 

Cuvinte cheie: ciclu replicativ VHC, inhibitori ai internalizãrii VHC, inhibitori de proteazã Ns3-4A, inhibitori de 

polimerazã Ns5B, inhibitorii Ns5A 

INTRODUCERE 

Infecţia cronică cu virusul hepatitei C 

(VHC) afectează 170 milioane de persoane 

(apro ximativ 3% din populaţia globului), devenind 

o importantă problemă de sănătate publică[1]. 

80% dintre pacienţii infectaţi vor 

dezvolta hepatită C cronică, urmată, în 20-40% 

din cazuri de evoluţie spre ciroză, decompensare 

hepatică, sau dezvoltarea carcinomului hepatic 

primitiv, pe plan mondial, infecţia cronică cu 

VHC reprezentând cauza cea mai frecventă de 

transplant hepatic. În absenţa unui tratament an- 

tiviral adecvat, numărul pacienţilor infectaţi 

VHC, cu boala hepatică în stadiu terminal, va 

creşte dramatic în următorul deceniu [2]. 

Înţelegerea mecanismelor moleculare din 

cursul ciclului replicativ VHC poate duce la dezvoltarea 

unui tratament antiviral specific, cu eficacitate 

sporită comparativ cu terapia standard 

recomandată în prezent (interferon pegylat alfa 

şi ribavirină). 

VHC face parte din familia Flaviviridae, 

genul hepacivirus. Este un virus anvelopat, cu 

genom ARN simplu spiralat de aproximativ 9,6 

*autor corespondent: simona Ruþã, Institutul de Virusologie Ştefan s. Nicolau, Şos. Mihai Bravu, nr. 285, 030304, Bucureşti, România, 

Telefon/Fax:+40213242590, e-mail: simona@simonaruta.ro 

15

VAGU et al. 

kb, cu polaritate pozitivă, ce codifică trei proteine 

structurale (core, E1, E2) şi şapte proteine 

non-structurale (p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, 

NS5A, NS5B). Regiunile noncodante de la capetele 

3’ şi 5’ ale genomului conţin secvenţe nucleotidice 

importante în reglarea replicării virale 

[3]. 

O serie de descoperiri recente permit o mai 

bună înţelegere a mecanismelor replicării virale 

[4]: 

1. repliconii genomici şi subgenomici VHC folosiţi 

pentru transfecţia in vitro a liniei Huh-7 au 

permis studierea ciclului replicativ VHC [5]; 

2. sistemele recombinante au facut posibilă izolarea 

în culturi celulare a particulelor infecţioase 

VHC [6]; 

3. un număr mare de particule asemănătoare virionilor 

VHC (VHC-like particles) au fost 

produse în culturi de insecte utilizând un baculovirus 

modificat [7]; 

4. s-au dezvoltat modelele animale (şoareci 

transgenici) ce pot susţine parţial replicarea 

virală [8, 9]. 

FAZA DE ECLIPSÃ A REPLICÃRII VIRALE - 

COMPUŞI ÞINTÃ PENTRU PROCESELE DE 

ADSORBÞIE ŞI INTERNALIZARE 

Adsorbţia VHC este iniţiată prin interacţiunea 

specifică între proteinele virale E1 şi E2 şi 

receptorii specifici de pe suprafaţa celulară, urmată 

de internalizare prin endocitoza mediată 

clatrina şi decapsidarea virusului. Posibilii liganzi 

pentru E1 şi E2 includ un complex de 

receptori şi coreceptori: tetraspanina CD81, 

claudina-1, ocludina, receptorul scavenger tipul 

1 clasa B (SR-B1), receptorul pentru LDL, 

glicozaminoglicanii, moleculele de adeziune 

intercelulară din celulele dendritice şi limfoide 

(DC-SIGN/L-SIGN) [5, 6]. 

Este de subliniat faptul că multe molecule 

implicate în metabolismul lipidic sunt esenţiale 

în această etapă: receptorul scavenger tipul 1 

clasa B (SR-B1) (principalul receptor pentru 

HDL), receptorul LDL şi, mai recent identificat, 

receptorul Niemann-Pick C1-like 1 (NPC1L1), 

exprimat doar pe hepatocitele umane şi ale primatelor. 

Se presupune că NPC1L1 mediază îndepărtarea 

colesterolului asociat virionilor, 

determinând modificări structurale ce facilitează 

internalizarea virusului [10]. 

Existenţa acestei interconexiuni între metabolismul 

lipidic şi internalizarea virală permit 

dezvoltarea unor agenţi antivirali care să acţioneze 

în fazele timpurii ale replicării virale: 

- Ezetimibe, un antagonist al receptorului 

NPC1L1, aprobat de FDA ca inhibitor selectiv 

al absorbţiei colesterolului, şi-a dovedit eficienţa 

in vitro inhibând internalizarea VHC, iar în 

cazul şoarecilor cu grefe de ficat uman s-a 

observat întârzierea debutului infecţiei cu genotip 

1 VHC [8]. 

- ITX 5061, iniţial recomandat pentru bolile 

inflamatorii, datorită acţiunii sale ca inhibitor de 

p38 MAP kinaza, şi apoi asociat cu creşterea nivelului 

de HDL atât la om, cât şi la animale de 

laborator. In prezent, se află în studii clinice de 

fază 1, ca inhibitor al etapelor post-adsorbţie virală. 

Acest compus ţinteşte receptorul scavenger 

tipul 1 clasa B (SR-B1) şi competiţionează pentru 

transferul HDL [11]. Studii in vitro au arătat 

că ITX 5061 are o acţiune inhibitorie sinergică 

în combinaţie cu interferonul alfa, ribavirina şi 

inhibitorii de protează şi polimerază virală [12]. 

Inhibiţia unor factori celulari implicaţi în 

etapele timpurii ale replicării virale este o opţiune 

terapeutică promiţătoare, ce şi-a dovedit 

deja eficienţa în cazul infecţiei HIV, prin utilizarea 

maravirocului - un inhibitor al coreceptorului 

pentru beta-chemokine CCR5. În cazul 

infecţiei VHC, inhibitorii receptorilor celulei gaz - 

dă pot fi alternative valoroase în prevenirea reinfecţiei 

grefei la pacienţii transplantaţi hepatic. 

FAZA DE CREŞTERE LOGARITMICÃ - 

COMPUŞII CU ACÞIUNE DIRECTÃ 

ANTIVIRALÃ (DAA) 

Etapa de creştere logaritmică a VHC se desfăşoară 

astfel: 

1. ARN-ul viral simplu spiralat cu polaritate 

pozitivă este eliberat în citoplasmă şi va servi 

direct ca ARNm în procesul de traducere a proteinelor 

virale. Genomul VHC conţine un singur 

cadru de citire deschis (ORF) care codifică un 

polipeptid format din ≈3,000 de aminoacizi, clivat 

ulterior de către enzimele virale şi celulare 

în proteine structurale şi nestructurale. Traduce- 

16

Agenþi terapeutici cu acþiune directã antiviralã în infecþia cu virus hepatitic C - noi þinte moleculare 

rea ARN-VHC este mediată de situsul intern de 

intrare în ribozomi (IRES), care stabileşte legături 

cu mai multe proteine celulare şi virale, incluzând 

subunitatea ribozomală 40S [13]; 

2. Poliproteina precursoare este tradusă de 

către proteazele virale şi peptidazele gazdei 

(peptidaza- şi peptid-peptidaza- semnal) în trei 

proteine structurale şi şapte nestructurale. NS2 

este o metaloprotează care clivează proteina 

NS2/NS3, în timp ce NS3/4A este o serin-protează 

ce clivează legăturile dintre NS3/NS4A, 

NS4A/NS4B, NS4B/NS5A şi NS5A/NS5B [14, 

15]. 

3. Replicarea virală este coordonată de către 

NS5B: ARN polimerază-ARN dependentă 

(RdRp). Această enzimă are o fidelitate scăzută 

de transcriere (rata încorporării greşite de nucleotide 

este 10 -3 per nucleotid per generaţie virală), 

ceea ce, asociat cu o rată foarte rapidă a 

replicarii virale (10 10 -10 12 virioni pe zi, cu un 

timp de înjumătățire de 2-3 ore), generează o 

mare variabilitate virală. S-au descris astfel 6 

genotipuri majore VHC (cu divergenţă de 30% 

în secvenţa de nucleotide), o serie de subtipuri 

în cadrul fiecarui genotip şi multe cvasispecii virale 

(ce diferă între ele cu mai puţin de 10% din 

nucleotide). Rezultatul acestei mari variabilităţi 

a VHC duce la selecţia unor mutante virale nonneutralizabile, 

ce persistă în organismul gazdă 

şi explică, cel puţin parţial, rata crescută de cronicizare 

a infecţiei VHC. De asemenea, din 

această populaţie virală înalt heterogenă, compuşii 

antivirali pot selecta mutantele rezistente, 

ceea ce este un argument pentru utilizarea unor 

combinaţii terapeutice. 

Faza de platou 

Ultima etapă a replicării virale - numită faza 

de platou - este iniţiată de interacţiunea între 

proteina core VHC şi ARN-ul genomic, care determină 

iniţierea asamblării virale. Virionii, 

asamblaţi în membranele lipidice intracelulare 

derivate din reticulul endoplasmic sau aparatul 

Golgi, sunt eliberaţi ulterior din celula gazdă 

[17]. NS5A este o fosfo-proteină fără activitate 

enzimatică, dar cu rol important în formarea 

complexului replicativ şi în asamblarea virală. 

NS5A acţioneaza probabil prin recrutarea unor 

kinaze specifice (fosfatidil inozitol kinaza 4, 

subtipul IIα-PI4KIIIα), stimulând activitatea 

acestora şi producţia locală de fosfatidil inozitol 

fosfat [18, 19]. Acesta determină recrutarea unor 

factori celulari de tipul ciclofilinelor A si B, care 

determină izomerizarea cis-trans, necesară replicării 

virale. Se presupune că membranele intracelulare 

reprezintă un suport pentru 

complexul replicativ [19], modificări conformaţionale 

ale acestora generând formarea aşa-numitei 

reţele membranare (membranous web), 

bogată în steroli [20]. 

INHIBITORII DE PROTEAZÃ NS3/4A 

Inhibitorii de Protează Aprobaţi. În anul 

2011, două medicamente cu administrare orală, 

Telaprevir (produs de Vertex Pharmaceuticals) 

şi Boceprevir (produs de Schering Plough/ 

Merck) au fost aprobate atât de Food and Drug 

Administration (FDA), cât şi de European Medicines 

Agency (EMA) pentru tratarea pacienţilor 

infectaţi cu genotipul 1 VHC, în combinaţie 

cu interferonul pegylat şi ribavirină. Nevoia unei 

triple terapii derivă din studiile ce au demonstat 

că monoterapia cu aceşti inhibitori de protează 

determină selecţia rapidă de mutante rezistente 

[21, 22]. Telaprevir şi Boceprevir sunt alfa-ketoamide 

peptidomimetice, care formează legături 

covalente reversibile cu serină din situsul 

activ al proteazei NS3, oprind clivarea poli - 

proteinei VHC în proteine virale funcţionale 

[15]. Inhibarea proteazei VHC poate asigura 

clearance-ul viral şi prin restaurarea răspunsului 

imun înnăscut, deoarece NS3/NS4A blochează 

factorul 3 reglator al interferonului (IRF3) şi 

ARN helicază celulară (RIG1), ceea ce duce la 

scăderea expresiei unor gene stimulate de interferon 

[23, 24]. 

În prezent, tripla terapie reprezintă opţiunea 

standard de tratament în cazul pacienţilor infectaţi 

cu genotipul 1 VHC. Aceasta a determinat o 

creştere a ratei de obţinere a răspunsului virusologic 

susţinut (RVS) atât la pacienţii naivi terapeutic, 

cât şi la cei cu răspuns parţial, cu recăderi 

sau fără răspuns virusologic anterior [25, 26, 27] 

(Tabelul 1). 

Telaprevir (Incivek/Incivo TM ) se administrează 

per os, (750 mg, 2 tablete de 375 mg, de 

3 ori pe zi) timp de 12 săptămâni, în combinaţie 

cu IFN pegylat alfa şi ribavirina. Durata trata- 

17

VAGU et al. 

Tabelul 1. Tripla terapie cu inhibitori de protează (telaprevir or boceprevir), 

interferon pegylat alfa-2a şi ribavirina (PegIFN/RBV) – studii clinice de faza 3 

Studiul clinic Pacieni/nr. Durata terapiei Scop i rezultate 

ADVANCE 

(telaprevir-TVR) 

[28] 

ILLUMINATE 

(telaprevir) 

[29] 

REALISE 

(telaprevir) 

[30] 

SPRINT 2 

(boceprevir) 

[31] 

RESPOND-2 

(boceprevir) 

[32] 

Pacieni naivi 

terapeutic/1088 

Pacieni naivi 


Pacieni cu eec 

terapeutic 

anterior/633 

Pacieni naivi 


Pacieni cu eec 

terapeutic 

anterior/403 

mentului depinde de nivelul încărcării virale 

ARN-VHC. Astfel, dacă ARN-VHC este nedetectabil 

în săptămânile 4 şi 12 de tratament, se 

administrază tripla terapie în primele 12 săptămâni, 

apoi dubla terapie (PEG-IFN plus ribavirină) 

încă 12 săptămâni. În schimb, dacă în 

săptămânile 4 şi 12, ARN-VHC este detectabil, 

dar în concentraţie mai mică de 1000 UI/ml, se 

administrează tripla terapie timp de 12 săptămâni, 

urmată de dubla terapie pentru încă 36 de 

săptămâni [33]. 

Boceprevir (Victrelis TM ) se administrează 

oral (800 mg de trei ori pe zi, în timpul mesei) 

pentru 24 - 44 săptămâni în combinaţie cu IFN 

pegylat alfa 2a şi ribavirină. Strategia terapeutică 

presupune inițierea tratamentului cu interferon 

şi ribavirină şi menţinerea lui timp de 4 

săptămâni (perioada de lead-in), apoi adăugarea 

de boceprevir. Scopurile fazei de lead- in sunt: 

reducerea replicării virale, împiedicarea selecţiei 

mutantelor rezistente, precum şi identificarea 

pacienţilor care au obţinut un răspuns virusologic 

rapid (RVR: viremie nedetectabilă după 4 

săptămâni de tratament), care au şanse mari de 

obţinere a RVS fără adăugarea unui inhibitor de 

protează [22, 34]. 

Pentru ambii inhibitori de protează, s-au stabilit 

regulile de oprire a tratamentului, dacă 

Tripla terapie pentru 

9/12 spt., apoi înc 12/36 

spt. cu PegIFN-RBV. 

Tripla terapie pentru 12 spt., 

apoi 12/24 spt. doar 

cu PegIFN-RBV. 

Tripla terapie pentru 12 spt., 

apoi înc 36 spt. 

de tratament doar 

cu PegIFN-RBV. 

4 spt. PegIFN-RBV, 

apoi tripla terapie 

pentru 24/44 de spt. 

4 spt. PegIFN-RBV, 

apoi tripla terapie 

pentru 32/44 spt. 

RVS-79% dup 12 sapt. de terapie 

tripl vs 46% cu PegIFN- RBV. 

92% din cei cu eRVR obin RVS la 

24 de spt. vs. 88% RVS la 48 spt. 

Rata RVS: la pacienii cu recdere: 

86% vs 22%; la cei cu rspuns 

parial: 59% vs 15%; la cei fr 

rspuns virusologic: 32% vs 5% 

RVS - 63–66% vs 38% în grupul 

control 

RVS - 59-66% la cei cu rspuns 

parial sau cu recdere anterioar vs 

21% în grupul control. 

a) eRVR (rspuns virusologic rapid extins) – nivelul ARN VHC nedetectabil în sptmânile 4 i 12; 

b) RVS- rspuns virusologic susinut 

viremia rămâne detectabilă în săptămânile 4 şi, 

respectiv 12, de triplă terapie [33, 34]. 

În cazul pacienţilor infectaţi cu genotipul 2 

sau 3 VHC, tratamentul standard rămâne cel cu 

IFN pegylat alfa şi ribavirină, durata terapiei 

este mai scurtă decât în cazul infecţiei cu genotipul 

1 (24 săptămâni vs 48 săptămâni), iar RVS 

este mai mare (80% vs sub 60% în cazul celor 

infectaţi cu genotipul 1) [35]. 

Noi inhibitori de protează de primă generaţie 

sunt în faze avansate ale studiilor clinice, scopul 

fiind de a se obţine medicamente cu 

efica citate superioară şi parametri farmacocinetici 

superiori (administrarea o dată sau de două 

ori pe zi şi durata mai scurtă a terapiei). Recăderea 

în urma triplei terapii determină apariţia 

mutantelor cu rezistenţă încrucişată la compuşii 

din aceeaşi clasă. Inhibitorii de protează de generaţia 

a doua, aflaţi în diferite stadii ale dezvoltării 

clinice, au activitate pan-genotipică, o 

barieră genetică mai înaltă şi un profil de rezistenţă 

distinct (Tabelul 2). 

INHIBITORII POLIMERAZEI NS5B 

NS5B este o ARN-polimerază ARN-dependentă, 

asemănătoare din punct de vedere structural 

cu reverstranscriptază HIV, având situsul 

catalitic alcătuit din 531 aminoacizi şi organizat 

18


Tabelul 2. Inhibitorii de protează de generația a doua 

Nume/Productor Activitate Studiul Clinic Rezultate anterioare 

Simeprevir (TMC435) 

Tibotec Pharmaceutical 

[36] 

BI201335/ 


Pharma [37] 

Asunaprevir 

(BMS 650032)/ 


[38] 

Danoprevir 

(ITMN191/RG7227)/ 

Roche 

[39,40]. 

Vaniprevir (MK-7009)/ 

Merck & Co. 

[41]. 

MK-5172/ 

Merck & Co. 

[42] 

ABT-450/ritonavir 

Abbott and Enanta 

[43] 

ACH-1625/ Achillion 

Pharmaceuticals 

[44] 

multiple genotipuri VHC 

(excepie-genotip 3) 

Activ pe multiple 

genotipuri VHC 

Activ pe genotipurile 1 i 

4 VHC 

Activ pe genotipurile 1, 4 

i 6 VHC 

Activ pe genotipurile 1 i 

2 VHC 

Activ pe toate 

genotipurile VHC, 


Activ pe genotipul 1 

VHC 


genotipurile VHC, 


III 

(în derulare) 

III 

(în derulare) 

IIa/IIb 

IIb 

In studii de faz IIb s-a obinut 

RVS de: 85% pt. pacienii cu 

recdere, 75% pt. cei cu rspuns 

parial i 51% pt. cei fr rspuns. 

RVS este de 71-83% la pacienii 

naivi i de 28-41% la cei tratai 

anterior. 

Rate crescute de RVT i RVS 

(80%) du 48 de spt. de terapie 

tripl, indiferent de polimorfismul 

IL28B . 

RVS la 67-93% din pacienii 

naivi terapeutic, fr ciroz, 

infectai cu genotipul 1 i 100% 

pt. genotipul 4. Activitatea 

antiviral superioar în asociere 

cu ritonavir. 

IIb La pacienii naivi, în spt. 12, 

rspuns virusologic 74-85% vs 

67-84% în spt.4 

II 

IIa 

IIa 

Scderea viremiei cu 4-5 log 10 la 

pacienii infectai cu genotip 1 si 

3. Activ pe majoritatea variantelor 

rezistente la inhibitorii de 

proteaz de prim generaie. 

RVT la 92% dintre pacienii naivi 

terapeutic, infectai cu genotip 1, 

dup 3 zile de monoterapie; se 

continu cu 12 spt. tripl terapie, 

apoi 48 spt. doar Peg-IFN/RBV. 

RVR la 75-81% dintre pacienii 

tratai cu tripl terapie vs 20% la 

pacienii tratai cu Peg-IFN i 

RBV 

a) RVT- rspuns virusologic timpuriu; b) RVS - rspuns virusologic susinut; c) RVR - rspuns virusologic rapid 

într-o structură tipică de “mână dreaptă” cu domeniile 

„palmă”, „degete” şi „police” [45]. 

Aceşti compuşi, la fel ca şi inhibitorii de reverstranscriptază 

HIV, sunt de două tipuri: 

Analogi nucleozidici (NI), ce competiţionează 

cu nucleotidele celulare, fiind integraţi 

preferenţial în genomul ARN progen, şi determinând 

stoparea elongării. Deoarece situsul 

activ al NS5B este o regiune înalt conservată a 

genomului VHC, NI sunt eficienţi împotriva diferitelor 

genotipuri şi subtipuri VHC. Aceşti 

compuşi aflaţi în faza a II-a a studiilor clinice, 

au eficienţă antivirală mai scăzută decât inhibitorii 

de protează, dar o barieră genetică de rezistenţă 

relativ ridicată (Tabelul 3). 

Inhibitorii non-nucleozidici (NNI) realizează 

inhibiţia NS5B prin inhibiţia allosterică a 

situsului catalitic, cu schimbarea conformaţională 

şi reducerea activităţii enzimatice. NS5B 

prezintă cel puţin 4 situsuri de legare a acestor 

compuşi (spre deosebire de RT HIV care are 

doar un singur situs), astfel încât diferiţi inhibitori 

de polimerază pot fi utilizaţi în combinaţie 

sau succesiv, pentru a împiedica dezvoltarea rezistenţei 

antivirale. NNI au o barieră genetică de 

rezistenţă scăzută, o activitate virală relativ redusă, 

evidentă doar în cazul infecţiei cu genotipurile 

1a şi 1b, şi ar putea fi utilizaţi doar în 

combinaţie cu alţi agenţi DAA (Tabelul 4). 

19

VAGU et al. 

Tabelul 3. Inhibitorii de polimerază - Analogii nucleozidici 

Nume/ Productor Activitate Studiul clinic Rezultate anterioare 

R7128/ 

Roche & Pharmasset 

[46]. 

Mericitabine (RG7128)/ 

Gilead 

[47]. 

PSI-7977/ Pharmasset, Inc 

[48], Sofosbuvir. 

INX-08189/BMS-986094/ 


[49] 

Activ pe multiple 

genotipuri VHC 


genotipurile VHC 

Activ pe genotipurile 

1, 2 i 3 VHC 

Activ pe genotipurile 

1, 2, 3 VHC 

a) RVR- rspuns virusologic rapid; b) RVS – rspuns virusologic susinut 

IIb 

IIb 

IIb 

IIb 

RVR-88% la pacienii naivi 

terapeutic infectai cu genotipurile 

2 i 3 i 90% la cei fr RVR. 

Procente crescute de RVR i RVS 

obinute la pacienii naivi infectai cu 

genotipurile 1 i 4. 

RVS-98% la pacienii naivi infectai 

cu genotipul 1. RVS crescut i pentru 

genotipurile 2 i 3, conform unui 

studiu pilot. 

Studiul de faz IIb a fost oprit 

în luna august 2012 din cauza 

toxicitii cardiace. 

INHIBITORI POTENÞIALI AI ASAMBLÃRII 

VIRALE 

Inhibitorii NS5A. Daclatasvir (BMS 

790052) este în faza a 3-a a studiilor clinice, se 

administrează împreună cu tratamentul standard 

(IFN pegylat alfa şi ribavirină), fiind activ pentru 

genotipurile 1 și 4 VHC. Daclatasvir, administrat 

per os în doză unică, a demonstrat o 

eficienţă deosebită, cu scăderea rapidă a viremiei 

[55]. Alţi agenţi antivirali se află în prezent 

în studii clinice de fază 1: PPI 461 (activ pentru 

toate genotipurile) şi GSK2336805 (activ pentru 

genotipurile 1a, 1b, 2a şi 4) [56]. 

Analogii ciclofilinelor celulare. Ciclofilinele 

sunt factori celulari implicaţi în împachetarea 

şi asamblarea multor proteine. Inhibitorii 

ciclofilinelor blochează interacţiunea acestora 

cu NS5A, şi implicit, formarea unui complex replicativ 

funcţional. Alisporivir (Debio-025) este 

un analog fara activitate imunosupresoare al ciclofilinelor, 

cu efect antiviral atât la pacienţii 

monoinfectaţi VHC, cât şi la cei coinfectaţi 

HIV/VHC. Studiile clinice au arătat că pacienţii 

infectaţi cu genotipurile 1, 3 şi 4 VHC, trataţi 

timp de 28 de zile cu Debio-25 şi IFN pegylat 

alfa, obţin o scădere semnificativă a încărcării 

virale VHC [57]. 

Tabelul 4. Inhibitorii polimerazei - Inhibitorii non-nucleozidici 

Nume/Productor Activitate Studiul Clinic Rezultate anterioare 

BI207127/ 


[50] 

Activ pe 

genotipul 1 

VHC 

IIa RVT - 92.3% obinut la pacienii naivi 

terapeutic i de 20% la cei pretratai. 

Filibuvir/ Pfizer 

[51] 

Activ pe 

genotipul 1 

IIb Rate de rspuns de 60-70% în spt. 48, 

ulterior, pân în spt. 60, 20-50% dintre 

pacieni vor face recderi. 

ABT 072/Abbott 

[52]. 

Activ pe 

genotipul 1 

IIa RVT la 70% dintre pacieni dup 12 spt. de 

tripl terapie. 

ANA598 (Setrobuvir)/ 

Anadys 

Activ pe 

genotipul 1 

IIb RVT la 73% dintre pacieni dup 12 spt. de 

tripl terapie 

[53] 

ABT 333/ 

Abbott 

Activ pe 

genotipul 1 

IIa RVT la 75% dintre pacieni dup 12 spt. de 

tripl terapie 

[52]. 

GS9190/ 

Gilead 

[54] 

Activ pe 

genotipul 1 

IIb Comparativ cu tratamentul standard (Peg- 

IFN+RBV), dup 24-48 spt. de tripl terapie 

se obine creterea RVT, fr creterea RVS. 

a) RVT – rspuns virusologic timpuriu; b) RVS – rspuns virusologic susinut 

20


Tabelul 5. Combinații terapeutice de agenți DAA cu mecanisme diferite de acțiune 

Ageni terapeutici combinai/ 

Productor 

Inhibitor de proteaz NS3 

(Danoprevir/ritonavir-boosted)+ 

Inhibitor nucleozidic NS5B (RG7128)/ 

Hoffmann-LaRoche/ Genentech [60]. 

Inhibitor de proteaza NS3 (Telaprevir)+ 

Inhibitor non-nucleozidic NS5B (VX-222)/ 

Vertex Pharmaceuticals [61]. 

Inhibitor de proteaza NS3 (BMS-650032)+ 

Inhibitor NS5A (BMS790052)/ 

Bristol-Myers Squibb [62]. 


(BI 201335) + Inhibitor non-nucleozidic 

NS5B (BI207127) Boehringer Ingelheim [63] 


(ABT-450/r) + 

Inhibitor non-nucleozidic NS5B (ABT072)/ 

Abbot Laboratories [64]. 

Inhibitori nucleozidici NS5B (PSI-7977 + 

PSI-938) / Pharmasset [65] 

RBV sau 

PegIFN-RBV 

Doar DAA 

Împreun cu 

PegIFN/RBV 

DAA cu/fr 

PegIFN/RBV 

Împreun cu 

RBV 

Împreun cu 

RBV 

Doar DAA 

Pacieni 

Naivi terapeutic 

sau pretratai 

Pacieni naivi 

Pacieni fr 

rspuns 

virusologic 

anterior 

Pacieni naivi 

terapeutic 

Pacieni naivi 

terapeutic 

Pacieni naivi 

terapeutic 

Comentarii 

Încrcarea viral VHC 

scade cu 5.1 log10 în 

cazul pacienilor naivi i 

cu 4.9 log10 la cei fr 

RVS anterior. 

RVS - 82-93% dup 

12 spt. de tratament 

(depinde de dozele 

de DAA) 

RVS la 5/11 pacieni 

tratai doar cu DAA i la 

9/10 pacieni tratai cu 

DAA plus PegIFN/RBV. 

RVR obinut la 100% 

dintre pacienii tratai 

cu doze mari. 

RVT de 91% la pacienii 

cu genotip IL28B CC, 

82% prezint ARN VHC 

nedetectabil dup 36 de 

spt. 

Bine tolerai i cu profil 

bun de siguran dup 

7-14 zile de tratament. 

a) RVS - rspuns virusologic susinut; b) RVR - rspuns virusologic rapid; c) RVT- rspuns virusologic timpuriu 

 

PERSPECTIVE 

Combinaţii terapeutice de agenţi DAA cu 

mecanisme diferite de acţiune. Prin analogie 

cu terapia HAART utilizată în infecţia HIV, este 

în curs de evaluare şi în infecţia cronică VHC o 

strategie bazată pe combinarea medicamentelor 

cu moduri diferite de acţiune ce ar putea creşte 

rata RVS şi reduce durata tratamentului. Se presupune 

că infecţia cronică VHC ar putea fi eradicată, 

deoarece replicarea VHC este strict 

localizată la nivelul hepatocitelor, intracitoplasmatic, 

şi nu există rezervoare virale extrahepatice 

(spre deosebire de HIV, care prezintă ADN 

proviral integrat în limfocite, sau VHB care 

poate genera ADNccc, integrat în genomul hepatocitului). 

Se apreciază că tripla terapie cu 

DAA poate duce la eradicarea virusului dupa 8- 

12 săptămâni, luând în calcul un model de clearance 

viral în 2 etape (o scădere bruscă cu 3.5 

log 10 a încărcării virale în primele 36 de ore, urmată 

de eliminarea virionilor liberi şi, ulterior, 

a hepatocitelor infectate) [58]. Perspectivele terapeutice 

[59] se bazează pe: 

Terapia cvadruplă, ce constă în asocierea 

a doi compuşi DAA cu IFN pegylat alfa şi ribavirină, 

poate fi eficientă în cazul pacienţilor cu 

recăderi, cu răspuns virusologic parţial sau fără 

răspuns la tratamentul anterior. 

Combinaţii terapeutice fără interferon. 

În cazul pacienţilor cu intoleranţă, contraindicaţii 

majore pentru administrarea interferonului sau 

cu răspuns virusologic foarte scăzut, se poate recomanda 

administrarea a doi compuşi DAA, cu 

barieră genetică înaltă, în asociere sau nu cu ribavirina. 

Cel mai probabil, ribavirina va fi menţinută 

în schemele terapeutice, deoarece a fost 

demonstrată activitatea ei antivirală directă, ce 

contribuie la obţinerea şi menţinerea răspunsului 

virusologic susţinut şi la scăderea ratei de recădere. 

Tabelul 5 cuprinde o parte din studiile aflate 

în diferite faze clinice de dezvoltare. 

21

VAGU et al. 

CONCLUZII 

Cunoaşterea în detaliu a ciclului replicativ 

VHC a condus la dezvoltarea unor compuşi cu 

acţiune directă asupra ciclului replicativ VHC 

(DAA) şi a agenţilor terapeutici care ţintesc proteinele 

gazdei, ce cresc eficienţa tratamentului 

standard cu interferon pegylat alfa şi ribavirină. 

La ora actuală, în cazul pacienţilor infectaţi cu 

genotipul 1 VHC, tripla terapie cu un inhibitor 

de protează plus interferon pegylat şi ribavirină 

reprezintă regimul terapeutic standard. Rezultate 

promiţătoare au fost obţinute în urma testării inhibitorilor 

de protează de generaţia a doua şi a 

inhibitorilor proteinei virale NS5A. În acelaşi 

timp, sunt în curs de evaluare diferite combinaţii 

de DAA cu sau fără interferon sau ribavarină, cu 

monitorizarea atentă a selecţiei tulpinilor virale 

multi-rezistente. 

MULÞUMIRI 

SULTANA CAMELIA a beneficiat de o 

bursă în cadrul Programului Operaţional Sectorial 

de Dezvoltare a Resurselor Umane (POS- 

DRU), finanţat din Fondul Social European şi 

Guvernul României prin contractul nr. POS- 

DRU/89/1.5/S/64109 

BIBLIOGRAFIE 

1. National Institutes of Health Consensus Development 

Conference Statement: Management of hepatitis C. 

Gastroenterology 2002. 123(6): 2082-2099. 

2. Deuffic-Burban S, Poynard T, Sulkowski MS, Wong 

JB. Estimating the future health burden of chronic hepatitis 

C and human immunodeficiency virus infections 

in the United States. J Viral Hepat 2007.14:107-115. 

3. Choo QL, Richman KH, Han JH, Berger K, Lee C, 

Dong C, Gallegos C, Coit D, Medina-Selby R, Barr 

PJ. Genetic organization and diversity of the hepatitis 

C virus. Proc Natl Acad Sci USA 1991. 88:2451-2455. 

4. Rice CM. New insights into HCV replication: potential 

antiviral targets. Top Antivir Med 2011.19:117–120. 

5. Blight KJ, McKeating JA, Rice CM. Highly permissive 

cell lines for subgenomic and genomic hepatitis C 

virus RNA replication. J Virol 2002.76:13001-13014. 

6. Wakita T, Pietschmann T, Kato T, Date T, Miyamoto 

M, Zhao Z, Murthy K. Production of infectious he - 

patitis C virus in tissue culture from a cloned viral 

genome. Nat Med 2005.11:791-796. 

7. Yu X, Qiao M, Atanasov I, Hu Z, Kato T, Liang TJ, 

Zhou ZH. Cryo-electron microscopy and three-dimensional 

reconstructions of hepatitis C virus particles. Virology 

2007. 367:126-34. 

8. Dorner M, Horwitz JA, Robbins JB, Barry WT, 

Feng Q, Mu K. A genetically humanized mouse model 

for hepatitis C virus infection. Nature 2011. 474:208- 

211. 

9. Washburn ML, Bility MT, Zhang L, Kovalev GI, 

Buntzman A, Frelinger JA, Barry W, Ploss A, Rice 

CM, Su L. A humanized mouse model to study hepatitis 

C virus infection, immune response, and liver disease. 

Gastroenterology 2011. 140:1334-1344. 

10. Sainz B Jr, Barretto N, Martin DN, Hiraga N, Imamura 

M, Hussain S, Marsh KA, Yu X, Chayama 

K, Alrefai WA, Uprichard SL. Identification of the 

Niemann-Pick C1-like 1 cholesterol absorption receptor 

as a new hepatitis C virus entry factor. Nat Med 

2012. 18(2):281-285. 

11. Syder AJ, Lee H, Zeisel MB, Grove J, Soulier E, 

Macdonald J, Chow S, Chang J, Baumert TF, 

McKeating JA, McKelvy J, Wong-Staal F. Small 

molecule scavenger receptor BI antagonists are potent 

HCV entry inhibitors. J Hepatol 2011. 54(1):48-55. 

12. Zhu H, Wong-Staal F, Lee H, Syder A, McKelvy J, 

Schooley RT, Wyles DL. Evaluation of ITX 5061, a 

Scavenger Receptor B1 Antagonist: Resistance Selection 

and Activity in Combination With Other Hepatitis 

C Virus. Antivirals J Infect Dis 2012. 205(4): 656-662. 

13. Otto GA, Puglisi JD. The pathway of HCV IRESmediated 

translation initiation. Cell 2004. 119:369– 

380. 

14. Lorenz IC, Marcotrigiano J, Dentzer TG, Rice 

CM. Structure of the catalytic domain of the hepatitis 

C virus NS2-3 protease. Nature 2006. 442:831–835. 

15. Bartenschlager R, Lohmann V, Wilkinson T, 

Koch JO. Complex formation between the NS3 serine-type 

proteinase of the hepatitis C virus and NS4A 

and its importance for polyprotein maturation. J Virol 

1995. 69:7519–7528. 

16. Neumann AU, Lam NP, Dahari H, Gretch DR, 

Wiley TE, Layden TJ, Perelson AS. Hepatitis C viral 

dy namics in vivo and the antiviral efficacy of interferon-alpha 

therapy, Science 1998. 282(5386):103-107. 

17. Vauloup-Fellous C, Pene V, Garaud-Aunis J, 

Harper F, Bardin S, Suire Y. Signal peptide peptidase-catalyzed 

cleavage of hepatitis C virus core protein 

is dispensable for virus budding but destabilizes 

the viral capsid. J Biol Chem 2006. 281:27679–27692 

18. Gao M, Nettles RE, Belema M, Snyder LB, Nguyen 

VN, Fridell RA, Serrano-Wu MH, Langley DR, 

Sun JH, O’Boyle DR. Chemical genetics strategy 

identifies an HCV NS5A inhibitor with a potent clinical 

effect. Nature 2010. 465: 96–100. 

19. Moradpour D, Penin F, Rice CM Replication of hepatitis 

C virus. Nat Rev Microbiol 2007. 5: 453–463. 

20. Reiss S, Rebhan I, Backes I, Romero-Brey I, Erfl 

H, Matula P, Kaderali L, Poenisch M, Blankenburg 

H, et al. Recruitment and activation of a lipid kinase 

by hepatitis C virus NS5A is essential for 

integrity of the membranous replication compartment. 

Cell Host & Microbe 2011. 9(1):32-45. 

21. Sarrazin C, Kieffer TL, Bartels D, Hanzelka B, 

Muh U, Welker M. Dynamic hepatitis C virus genotypic 

and phenotypic changes in patients treated with 

the protease inhibitor telaprevir. Gastroenterology 

2007.132:1767–1777. 

22


22. Susser S, Welsch C, Wang Y, Zettler M, Domingues 

FS, Karey U, Hughes E, Ralston R. Characterization 

of resistance to the protease inhibitor boceprevir in 

hepatitis C virus-infected patients. Hepatology 2009. 

50:1709–1718. 

23. Gale MJr, Korth MJ, Katze MG. Repression of the 

PKR protein kinase by the hepatitis C virus NS5A protein: 

a potential mechanism of interferon resistance. 

Clinical and Diagnostic Virology 1998. 10 (2-3):157– 

162. 

24. Johnson C, Owen D, and Gale MJr. Functional and 

therapeutic analysis of hepatitis C virus NS3/4A protease 

control of antiviral immune defense. Journal of 

Biological Chemistry 2007. 282 (14): 10792–10803. 

25. Pearlman L. Protease inhibitors for the treatment of 

chronic hepatitis C genotype-1 infection: the new standard 

of care–review. The Lancet Infectious Diseases 

2012. 12(9):717-728. 

26. Bacon BR, Gordon SC, Lawitz E, Marcellin P. Boceprevir 

for previously treated chronic HCV genotype 

1 infection. N Engl J Med 2011. 364:1207-1217. 

27. Zeuzem S, Andreone P, Pol S, Lawitz E. Telaprevir 

for retreatment of HCV infection. N Engl J Med 2011. 

364:2417-2428. 

28. Jacobson IM, McHutchison JG, Dusheiko G. 

Telaprevir for previously untreated chronic hepatitis C 

virus infection. N Engl J Med 2011. 364:2405- 2416. 

29. Sherman KE, Flamm SL, Afdhal NH, Nelson DR, 

Sulkowski MS, Everson GT. Response-guided 

telaprevir combination treatment for hepatitis C virus 

infection. N Engl J Med 2011. 365: 1014-1024. 

30. Foster GR, Zeuzem S, Andreone P, Pol S, Lawitz 

EJ, Diago M, Roberts S. et al Subanalyses of the 

telaprevir lead-in arm in the REALIZE study: response 

at week 4 is not a substitute for prior null response 

categorization. J Hepatol 2011. 54, S3-S4. 

31. Poordad F, McCone J. Jr, Bacon BR, Bruno S, 

Manns MP, Sulkowski MS. Boceprevir for untreated 

chronic HCV genotype 1 infection. N Engl J Med 

2011. 364:1195–1206 

32. Bacon BR, Gordon SC, Lawitz E. HCV RESPOND- 

2 final results: high sustained virologic response 

among genotype 1 previous nonresponders and relapsers 

to peginterferon/ribavirin when re-treated with 

boceprevir plus pegintron (peginterferon alfa-2b)/ribavirin. 

Hepatology 2010. 52: 430A. 

33. US Food and Drug Administration. Approval of Incivek 

(telaprevir), a direct acting antiviral drug (DAA) 

to treat hepatitis C (HCV). Available from: 

http://www.fda.gov/ForConsumers/ByAudience/For- 

PatientAdvocates/ucm256328.htm 

34. US Food and Drug Administration. Approval of Victrelis 

(boceprevir), a direct acting antiviral drug 

(DAA) to treat hepatitis C virus (HCV). Available 

from: http://www.fda.gov/ForConsumers/ByAudience/ForPatientAdvocates/ 

ucm255413.htm 

35. Zeuzem S, Berg T, Moeller B, Hinrichsen H, Mauss 

S, Wedemeyer H, Sarrazin C, et al. Expert opinion 

on the treatment of patients with chronic hepatitis C. 

J Viral Hepat 2009. 16(2): 75–90. 

36. Marcellin P, Reesink H, Berg T, Cramp M, Flisiak 

R, Van Vlierberghe H, Verloes R, Lenz O, Peeters 

M, Sekar V, De Smedt G. Antiviral activity and 

safety of TMC435 combined with peginterferon a-2a 

and ribavirin in patients with genotype-1 hepatitis C 

infection who failed previous IFN-based therapy. J 

Hepatol 2009. 50: S 385 

37. Sulkowski MS, Bouliere M, Bronowicki J-P, 

Streinu-Cercel A, Preotescu L, Asselah T, et al. 

SILEN-C2: sustained virologic response (SVR) and 

safety of BI201335 combined with peginterferon alfa- 

2a and ribavirin (P/R) in chronic HCV genotype-1 patients 

with non-response to P/R J Hepatol 2011, 54: 

S30 

38. Bronowicki J-P, Pol S, Thuluvath P. Asunaprevir 

(ASV; BMS-650032), an NS3 protease inhibitor, in 

combination with peginterferon and ribavirin in treatment-naive 

patients with genotype 1 chronic hepatitis 

C infection). J Hepatol 2011. 54: S472. 

39. Everson G, Cooper C, Hézode C, Shiffman ML, 

Yoshida E, Beltran-Jaramillo T, Ferenci P. Rapid 

and sustained achievement of undetectable HCV RNA 

during treatment with ritonavir-boosted danoprevir/ 

Peg-IFNα-2A/RBV in HCV genotype 1 or 4 patients: 

DAUPHINE week 12 interim analysis. The EASL International 

Liver Congress 2012, Barcelona April 18- 

22, 2012 

40. Gane E, Rouzier R, Stedman C, Wiercinska-Drapalo 

E, Horban A, Chang L, Zhang Y. Ritonavir 

boosting of low dose RG7227/ITMN-191, HCV 

NS3/4A protease inhibitor, results in robust reduction 

in HCV RNA at lower exposures than provided by unboosted 

regimens. J Hepatol 2010. 52: S16-S17 

41. Manns M, Lee A. Sustained viral response (SVR) 

rates in genotype 1 treatment-naïve patients with 

chronic hepatitis C (CHC) infection treated with vaniprevir 

(MK-7009), a NS3/4a protease inhibitor, in 

combination with pegylated interferon alfa-2a and ribavirin 

for 28 days. http://www.natap.org/2010/ 

AASLD/AASLD_24.htm 

42. S. Ludmerer, N. Liverton, J. McCauleya. Discovery 

of MK-5172 a next generation HCV NS3/4a protease 

inhibitor: raising the bar of this important class of molecules, 

International Conference on Viral Hepatitis 

2012, New York, March 26-27, 2012. Abstract 79328. 

43. Lawitz E, Gaultier I, Poordad F, Cohen DE, 

Menon R, Larsen LM. 1220 ABT-450/ritonavir 

(ABT-450/R) combined with pegylated interferon 

alpha-2A and ribavirin (SOC) after 3-day monotherapy 

in Genotype 1 HCV-infected treatment-naive subjects: 

12-week interim efficacy and safety results. J 

Hepatol 2011. 54: S482. 

44. Lalezari J, Hazan L, Kankam M, Lawitz E. High 

rapid virologic response (RVR) with ACH-1625 daily 

dosing plus pegIFN-Alpha 2A/RBV in a 28-day phase 

2A trial. 62nd Annual Meeting of the American Association 

for the Study of Liver Diseases. San Francisco, 

Nov 6-9, 2011. Abstract 1341. 

45. Bressanelli S, Tomei L, Roussel A, Incitti I, Vitale 

RL, Mathieu M, De Francesco R, Rey FA. Crystal 

structure of the RNA-dependent RNA polymerase of 

hepatitis C virus, PNAS 1999. 96 (23): 13034–13039. 

46. Gane EJ, Rodriguez-Torres M, Nelson DR. Antiviral 

activity of the HCV nucleoside polymerase in- 

23

VAGU et al. 

hibitor R7128 in HCV genotype 2 and 3 prior non-responders: 

interim results of R7128 1500mg BID with 

PEG-IFN and ribavirin for 28 days. Hepatology 2008. 

48: ALB10. 

47. Jensen DM, Wedemeyer H, Herring RW, Ferenci 

P, Ma MM, Zeuzem S, Rodriguez-Torres M, et al. 

High rates of early viral response, promising safety 

profile and lack resistance-related breakthrough in 

HCV GT1/4 patients treated with RG7128 plus 

pegIFN alfa-2a (40KD)/RBV: planned week 12 interim 

analysis from the PROPEL study. 61st Annual 

Meeting of the American Association for the Study of 

Liver Diseases. Boston, October 29 - November 2, 

2010, Abstract 81. 

48. Lawitz E, Lalezari JP, Hassanein T, et al. Oncedaily 

PSI-7977 plus Peg/RBV in treatment-naïve patients 

with HCV GT1: robust end of treatment 

response rates are sustained post-treatment. Hepatology 

2011. 54 (suppl 1):225. 

49. U.S. National Institutes of Health. ClinicalTrial.gov, 

Phase 2b study of BMS-986094 and daclatasvir, with 

or without ribavirin for the treatment of patients with 

chronic hepatitis C, available from http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01629732 

50. Larrey D, Levin J, Lohse A, de Ledinghen V, Trepo 

C, Gerlach T. 4 week therapy with the non-nucleosidic 

polymerase inhibitor BI 207127 in combination 

with peginterferon alfa2A and ribavirin in treatment 

naïve and treatment experienced chronic HCV GT1 

patients. Journal of Hepatology 2010. 52 (suppl 1): 

S466 

51. Jacobson IM, Pockros PJ, Lalezari J, Lawitz E, 

Rodriguez-Torres M, et al. Virologic response rates 

following 4 weeks of filibuvir in combination with pegylated 

interferon alfa-2a and ribavirin in chronically 

infected HCV genotype 1 patients. J Hepatol 2010. 52 

(suppl 1): S465 

52. Middleton T, He Y, Beyer J. Factors affecting HCV 

viral load response to the non-nucleoside polymerase 

inhibitors ABT-072 and ABT-033. J Hepatol 2011, 54 

(suppl 1): S483-S484. 

53. National AIDS Treatment Advocacy Project Organisation 

(NATAP). ANA-598 HCV non-nuke Phase 2b 

study preliminary data results, 2011. Available from: 

http://www.natap.org/2011/HCV/101411_01.htm. 

54. U.S. National Institutes of Health-ClinicalTrial.gov. 

Efficacy and safety study of GS-9256 and GS-9190 

Alone and in Combination With Ribavirin for 28 Days 

in Patients With Chronic Hepatitis C Virus Infection. 

Available from: http://clinicaltrials.gov/ct2/show/ 

NCT01072695 

55. Nettles R, Chien C, Chung E, Persson A, Gao M, 

Belema M. BMS-790052 is a first-in-class potent hepatitis 

C virus (HCV) NS5A inhibitor for patients with 

chronic HCV infection: Results from a proof-of-concept 

study. Hepatology 2008. 48(suppl): LB12–LB12. 

56. Lalezari JP, Agarwal K, Dusheiko G. Dose-ranging 

trial of PPI- 461, a potent new pan-genotypic HCV 

NS5A inhibitor, in patients with HCV genotype-1 infection. 

Hepatology 2011. 54:400A. 

57. Flisiak R, Feinman SV, Jablkowski M. The cyclophilin 

inhibitor Debio 025 combined with PEG- 

IFN alpha2a significantly reduces viral load in treatment 

naive hepatitis C patients. Hepatology 2009. 

49:1460-1468. 

58. Ohara E, Hiraga N, Imamura M, et al. Elimination 

of hepatitis C virus by short term NS3-4A and NS5B 

inhibitor combination therapy in human hepatocyte 

chimeric mice. J Hepatol 2011. 54: 872–878. 

59. Zeuzem S, Buggisch P, Agarwal K. Dual, triple, and 

quadruple combination treatment with a protease inhibitor 

(GS-9256) and a polymerase inhibitor (GS- 

9190) alone and in combination with ribavirin (RBV) 

or PegIFN/RBV for up to 28 days in treatment-naive, 

genotype 1 HCV subjects. The 61st Annual Meeting 

of the American Association for the Study of Liver 

Diseases. Boston, October 29 - November 2, 2010, 

Abstract LB-1. 

60. Gane EJ, Roberts SK, Stedman CA. Oral combination 

therapy with a nucleoside polymerase inhibitor 

(RG7128) and danoprevir for chronic hepatitis C 

genotype 1 infection (INFORM-1): a randomised, 

double-blind, placebo-controlled, dose- escalation 

trial. Lancet 2010. 376:1467-1475. 

61. Nelson DR, Gane EJ, Jacobson IM, Di Bisceglie 

AM, Alves K, Koziel MJ. VX-222/Telaprevir in combination 

with peginterferon-alfa-2a and ribavirin intreatment-naive 

genotype 1 HCV patients treated for 

12 weeks: Zenith study, SVR 12 interim analyses. Hepatology 

2011. 54:1442. 

62. Lok AS, Gardiner DF, Lawitz E. Combination therapy 

with BMS-790052 and BMS-650032 alone or 

with PEGIFN/RBV results in undetectable HCV RNA 

through 12 weeks of therapy in HCV genotype 1 null 

responders. Hepatology 2010. 52:877A. 

63. Zeuzem S, Asselah T, Angus PW. Strong antiviral 

activity and safety of IFN-sparing treatment with the 

protease inhibitor BI 201335, the HCV polymerase inhibitor 

BI 207127 and ribavirin in patients with 

chronic hepatitis C. Hepatology 2010, 52:876A. 

64. Lawitz E, Poordad F, Kowdley KV. A 12-week interferon-free 

regimen of ABT-450/r, ABT-072, and 

ribavirin was well tolerated and achieved sustained virologic 

response in 91% treatment-naïve HCV IL28B- 

CC genotype-1-infected subjects. EASL International 

Liver Congress 2012, Barcelona April 18-22, 2012. 

Abstract 13. 

65. Lawitz E, Rodriguez-Torres M, Denning J. Once 

daily dual nucleotide combination of PSI-938 and PSI- 

7977 provides 94% HCV RNA

GROWTH OF ENTAMOEBA INVADENS IN SEDIMENTS WITH 

METABOLICALLY REPRESSED BACTERIA LEADS TO MULTICELLULARITY 

AND REDEFINITION OF THE AMOEBIC CELL SYSTEM 

Vladimir F. Niculescu* 

institute for Zoology and department of biology iii, University of tübingen, Germany, 

and sero-screen Laboratories augsburg, Germany 

ABsTRACT 

Extracellular signaling and mechanisms of cell differentiation in Entamoeba are misunderstood. The 

main reason is the popular use of axenic media, which do not correspond to the natural habitats of Entamoeba. 

The axenic environment lacks the exogenous activators and repressors provided by natural 

habitats. Absent bacterial commensals understanding of the development of the amoebic cell system 

remains deficient. The present Aa(Sm) culture method using mixed sediments of antibiotically repressed 

Aerobacter aerogens and amoebae was developed to model in vitro extracellular signaling 

that induce multicellularity in cultures of E. invadens. Repressed oxygen consuming sediment bacteria 

supply E. invadens the hypoxic environment needed for differentiation and development. The amoebae 

themselves alter the environment by consuming the bacteria by phagocytosis thus reversing hypoxia. 

Exogenous activators are in this manner down regulated and suppressed. This feedback effect controls 

amoebic development and differentiation. Co-existing cell types and cell fractions with different life 

spans and cell cycle length could be identified. Aa(Sm) long term cultures contain continuous and 

non-continuous self renewing cell lines producing quiescent and terminally differentiated daughter 

cells (precysts) by asymmetric division. This culturing method helps to understand the intimate relationship 

between hypoxic environments and the multicellular behaviour of E. invadens and the interrelations 

existing between the distinct cell types. 

Keywords: entamoeba, hypoxia, differentiation, quiescence, terminal differentiation, cyclic and non-cyclic 

encystment, cell conversion. 

Abbreviations: LT, long term cultures; D1, D2, non-identical daughter cells by asymmetric division, SRL, self renewing 

lines comprising D1 cells; QD24 LT , TD6 LT , self renewing lines producing differentiated quiescent (QD) 

and terminally differentiated (TD) cells by asymmetric cell division; CE, DI, cysts by cyclic encystment and 

direct induction; Aa(Sm), culture medium containing bacterial sediments with aerobacter aerogenes (Aa), after 

preconditioning with serratia marcescens (sm). 

INTRODUCTION 

After 1968, axenic medium TPS-S-1 and its 

variants BI-S-33, TYI-S-33 [1-3] have become 

extremely popular. Many researchers decided to 

use bacteria-free cultures as they are most advantageous 

for basic molecular and genetic studies, 

but then began to recognize that axenic cultures 

are not well suited to elucidate the cell biology 

of Entamoeba. Important aspects regarding cell 

cycle and differentiation remained unclear, since 

in the bacteria-free cultures, naturally occurring 

hypoxic micro-niches and specific environmental 

triggers are missing. Also important physiological 

traits such as virulence were lost in 

axenic cultures [4]. Axenic media mainly used 

in the past 45 years have been restricting our understanding 

of the cellular biology of Entamoeba 

in that the Entamoeba are being grown 

in an environmental straight jacket which has 

little to do with their natural environment. 

*Corresponding author: Vladimir Florin Niculescu, D-86420 Diedorf, Germany, Kirschenweg 1; 

e-mail: besnea@aol.com; Vladimir.Niculescu@yahoo.com 

25

VLADIMIR F. NICULESCU 

In xenic cultures, living bacteria are required 

to support amoebic growth. Heat-inactivated 

bacteria support no amoebic growth [5, 6]. 

Mirelman [6] investigated the question of what 

the bacteria provided to the amoeba in culture. 

One hypothesis suggested that bacteria provide 

anaerobic conditions or redox potentials that are 

suitable for amoebic life [7-9]. Another theory 

suggested that products of bacterial metabolism 

are essential for the amoebae [10]. 

Bracha and Mirelman [4] showed that prolonged 

axenic cultivation of E. histolytica decreased 

its virulence, yet the ability of amoebae 

to cause lesions was markedly enhanced after 

reassociation with natural or opsonized bacteria, 

if an intimate surface contact between E. histo - 

ly tica and the added bacteria was provided. 

They concluded that the attachment of bacteria 

apparently stimulates the electron transport system 

of the amoeba. Similar results were obtained 

in low-oxygen environments conditions 

using a nitrogen- containing atmosphere with 

5% O2 and 10% CO2. 

The purpose of our study was to improve 

the xenic culture method by exploring a more 

appropriate environment for better understanding 

the cell cycle and differentiation in E. invadens. 

The aim was to prevent the unrestricted 

bacterial growth, which disturbs amoebic 

growth, while providing the intimate surface 

con tact and the essential amoebic growth factors 

produced by bacteria. We decided to use for our 

investigations a non-growing bacterial mass of 

oxygen consuming bacteria in mixed sediments 

with amoebae. We also intended to determine if 

products of bacterial metabolism whether from 

the same strain or not, could be provided separately 

by preconditioning the basic medium. The 

goal of our study was a better understanding of 

the inductive environmental stimuli controlling 

the amoebic cell cycle and cell fate decisions of 

E. invadens. 

We assumed that the interplay between the 

oxygen consuming bacteria and the phagocytic 

amoebae would modify the hypoxic state of the 

culture sediment continuously. Aerobic bacteria 

attracted our interest. It is known that gram-ne - 

gative bacteria, such as Aerobacter aerogenes, 

require oxygen to survive and grow, and that 

bacterial biomass consumes oxygen and releases 

carbon dioxide even when in stationary phase. 

The oxygen content in an active A. aerogenes 

log culture decreases with a continuously decreasing 

rate from about +248 Eh / mV aerobiosis 

down to -205 units / mV anaerobiosis [11]. 

The culture pH values change from 6.8 to 5.2. 

At the end of the bacterial log phase the rate of 

oxygen consumption decreases until it reaches 

a low but constant rate [12]. 

The present paper describes the culture me - 

thodology for the growth of amoebae in hypoxic 

modulated culture sediments with A. aerogenes. 

The advantages of variable low oxygen contents 

in the decryption of the cell biology of E. invadens 

are presented. The new culture method 

allows for the characterization of distinct subpopulations 

of cell types which could not be 

otherwise observed in vitro. These findings are 

from the author’s early work and were briefly 

reported [13, 14]. At that time interpretation of 

the results was not possible in the absence of 

what is known today on stem cell biology. Yet 

by following population development, the presence 

of extracellular signals was deduced. 

Evaluating the growing culture requires previous 

homogenization of the culture which is 

problematic, as stirring disturbs the hypoxic 

conditions that are being monitored during 

amoebic growth and development. Stirred culture 

sediments may be reestablished by centrifugation 

and E. invadens continues proliferation, 

however it differs from unstirred samples grown 

in parallel. Stirring may restore oxidative redox 

potentials in the culture [15]. Oxidative stress 

generally drives eukaryotic cells to negative outcomes 

such as growth inhibition or cell death, 

or arrest at specific redox-sensitive checkpoints 

[16-20] and causes disruption of intracellular 

redox homeostasis [21] that prevent the mitotic 

proliferation [22, 23]. It occasionally leads to 

positive outcomes, such as cell activation and 

proliferation [24, 25]. 

MATERIALS AND METHODS 

Organisms 

The TR2 / 1 strain of E. invadens (Madagas - 

car) was a kind gift from Douglas Cameron 

26

Multicellularity in single-celled eukaryotes 

Barker, Department of Zoology, University of 

Edinburgh, Scotland. This strain was found to 

be easily handled under controlled conditions 

and fit the many prerequisites for an experimental 

cell system. An aerobic bacterial strain was 

sought which, under bacteriostatic repression, 

would be able to remain metabolically active 

and thus ensure the necessary redox potentials 

and partial anaerobiosis required to sustain the 

amoeba population. It also must be able to be 

consumed by phagocytosis and serve as food for 

the amoeba. The 20 strains screened for 

suitability were kindly provided by the Institute 

of Hygiene, University of Tübingen. Best 

growth re sults were achieved by preconditioning 

the medium with S. marcescens (Sm), and 

using A. aerogenes (Aa) strain AH8 in the culture 

sediment for redox regulation and phagocytosis 

by amoebae. The culture medium was 

therefore refered to as Aa(Sm) CM. 

Basic medium (BM) 

The stock solutions for the basic medium 

are: (a) bovine serum 10% in distilled water, autoclaved 

(121°C, 10 min) and then stored cool 

for several days (


at 4°C (up to 30 days). Opsonized bacterial cells 

are added for the Aa(Sm) culture medium which 

is now ready for growing amoebae. En- and excystment 

experiments were started with freshly 

harvested bacteria. 

Inoculum 

The culture was carried out in 10 ml centrifuge 

glass U-tubes containing 5 ml of CM, 5 

mg of A. aerogenes AH8 bacteria and 0.5 or 1.0 

x 10 6 amoebae. The bacteria were inhibited by 

a combination of streptomycin and erythromycin. 

After addition of the amoeba inoculants, the 

tubes were centrifuged at 1,000 rpm to gently 

form a solid breeding sediment on the tube bottom 

and incubated at 28°C. The antibiotic-repressed 

bacterial mass provides the redox 

environments for optimal amoebic growth. 

Amoe bae consumed bacteria in the sediment. 

The medium remained transparent. Bacterial superinfections 

producing opacity and precipitation 

were therefore easy to detect. Aa(Sm)-CM 

supports ex-cystment, growth and cyclic encystment 

of E. invadens. All work was performed 

under sterile conditions. 

Quantitative analysis 

The size of the amoeba population was determined 

using a hematologic counting chamber. 

All cell counts were performed under microscope. 

Cysts were identified visually. In order to 

evaluate the population density of amoebae the 

contents of a culture tube needed to be homogenized 

by stirring. The contents of culture tubes 

(culture sediment and liquid) were mechanically 

homogenized by stirring and sucked up and 

down using a sterile 2 ml glass pipette. The contents 

of the culture tubes were thus also aerated. 

This is a serious problem as evaluation of each 

culture altered the redox environment and influenced 

later development in the Aa(Sm) culture. 

The effects of changing redox status due to the 

aeration caused by the first measurement were 

examined, by taking a second measurement at a 

later point. After sampling, the culture sediment 

was recovered by centrifugation. Later to minimize 

the impact of counting on population kinetics, 

many duplicate samples were started in 

parallel, each of which may be examined only 

once, then discarded. 

RESULTS 

Culture sediments with oxygen consu - 

ming bacteria provided optimal hypoxic 

conditions for growth and development of 

E. invadens 

Work previous to this study showed that E. 

invadens preferred low oxygen levels and opsonized 

A.aerogenes. Aminoglycosides such as 

streptomycin and macrolides such as erythromycin 

added in moderate doses to the Aa(Sm) 

stopped bacterial growth by inhibiting protein 

synthesis. The advantage of the Aa(Sm) sediment 

culture is the hypoxic dynamics occurring 

during the interplay between the antibiotically 

regulated bacteria and the phagocytic amoebae. 

Amoebae consume the bacteria by predation reversing 

the hypoxia. The initial consumption of 

oxygen by the bacteria and the subsquent consumption 

of the bacteria by the growing amoeba 

modulate the hypoxic conditions causing chan - 

ges in growth phases and development in E. invadens 

(Fig. 1). The large number of bacteria at 

the beginning of growth and the rapid oxygen 

depletion in the early initiation phase (0-2 h) induce 

mitotically active cells. During the growth 

phase (4-72 h) when amoebae feed on the oxygen 

consuming bacteria from the culture sediment, 

hypoxia is gradually reversed. As opposed 

to axenic culture media the environmental 

changes occuring in the Aa(Sm) culture, mimic 

the extracellular signaling from natural habitats 

and reveal new insights concerning growth, cell 

cycle and multicellularity in developmental 

populations of E. invadens. 

Growth and differentiation 

The initiation phase (0 - 4 h)*. The initiation 

phase begins at t0 and ends at t4 when 

amoebic population has doubled. In the early 

initiation phase (0-2 h) dissolved oxygen in the 

sediment is consumed rapidly by the bacteria. 

Mitotic activators cause all passaged cells to reenter 

and continue the cell cycle. In the late subphase 

(2-4 h) amoeba make the first asymmetric 

cell division; 

The growth phase I (5 - ca 30 h) * . With 

continuing growth the amoeba population increases 

and the bacteria are consumed decreasing 

their population. 28 - 30 h after culture 

* 

The duration of individual stages of growth indicates average time periods 

28


t0 t4 t30 t72 t96 

initiation growth I growth II pre-stationary stationary 

3,5 

3,0 

2,5 

2,0 

1,5 

1,0 

0,5 

c 

v 

c 

v 

c 

v 

c 

v 

c (cysts) 

v (vege-tative cells) 

t 0 24 48 72 96 

c( x 104) 0.60 3.00 3.50 3.45 3.50 

v( x 106) 0.50 1.08 1.54 2.04 2.01 

Ratio(%) 1.20 2.77 2.27 1.69 1.74 

Ratio=c/v 

Fig. 1 - TD6 LT and QD24 LT in the cyst producing LT- culture of E. invadens 

The LT- passage was 

F 

started with 5 ml of culture medium CM and 5 mg of bacteria in the culture sediment. It began with 

0.5 x 10 6 large QD24 LT cells and 0.6 x 10 4 TD6 LT cells. A population of about 2 x 10 6 large vegetative cells (v) reached the 

pre-stationary phase, 72 h after the start. The number of cysts (c) at the end of the growth phase has increased to 3.5 x 10 4 . 

The total population of large vegetative cells was then up to 98%, which did not form cysts and death in the apoptotic 

phase. The ratios values showed the relative numbers of cysts in comparison to the prevailing vegetative cells. The different 

kinetics of the two cell lines has a ratio reduction from 2.77% (t0) to 1.69% (t72) 

inoculation, decreasing hypoxia arrested proli - 

fera tion of the cyst-producing subpopulation, as 

described below. This critical point marks the 

passage from the more hypoxic growth phase I 

to the low hypoxic growth phase II; 

The growth phase II (30 - 72 h)*. In this 

phase only the cyst-free subpopulation continues 

proliferation and consumes the bacteria until 

the hypoxic growth stimuli no longer exist. At 

the end of this phase 80 % of the cyst-free subpopulation 

is mitotically inactive as a quiescent 

cell fraction continuing phagocytosis. The few 

remaining bacteria provided cannot sustain hypoxic 

conditions. 

The pre-stationary phase (72 - 96 h)*. In 

this phase the number of cell divisions is clear. 

But in some cases other than Fig. 1 a few symmetric 

divisions were observed. 

The stationary phase (97 - 124 h)*. Cultures 

enter this absolute stationary phase when 

net growth is zero and the amoebic subpopulations 

experience oxidative stress and other 

growth limiting factors. 

The vegetative death phase begins at the 

moment when vegetative cell metabolism can 

no longer be maintained in the culture. 144 h 

after start, the vegetative cells showed increased 

lysis, but not encystment. Their senescence was 

irreversibly programmed. Thus, in the first 3-4 h 

of recultivation about one-third of the 144 h 

inoculum went apoptotic. 

Subpopulations During a period of four 

years more than 100 passages of multicellular 

Aa(Sm) culture were examined. In the long term 

cultures (LT culture), two subpopulations were 

observed, namely (i) a major significant cystfree 

subpopulation (90-98% of total population) 

and (ii) a minor cyst-containing subpopulation 

which supports cell -cycle associated encystment. 

An additional metacystic subpopulation 

was generated by excysted amoebulae, however 

it was quantitatively insignificant in the culture 

from Fig. 1 (


ned (D1 cells) and act as a stable self-renewing 

cell line (SRL) whereas the other 50% cells are 

mitotically repressed (D2 cells); they exit cell 

cycle, accumulating in a differentiated cell compartment. 

Asymmetric division and cell cycle 

exit are markers for cell differentiation and the 

mitotically repressed D2 cells are quiescent differentiated 

cells (QD cells). Self renewing lines 

remained thereby constant in number and the 

population growth by quiescent and cyst units 

respectively by accumulation of cells in the differentiated 

cell reservoirs of each subpopulation 

as seen in Fig. 1. 

Amoebic growth follows an arithmetic progression. 

Extracellular starting signals from the 

early initiation phase reactivate all passaged cell 

fractions for cell cycle progress and cell division. 

240 min after the start amoebic population 

doubled by asymmetric differentiative division 

producing once more 50% self renewing cells 

(D1) and 50% differentiated cells (D2). Further, 

each subpopulation grows arithmetically. The finite 

formula for successive members of this 

arithmetic growth progression is half the sum 

between the previous progression members 

(pm) and the later ones 

pm (x) = [ pm (x+1) + pm (x-1) ] : 2 (1) 

If the valid term for the amobic inoculum 

is ai and the common difference of successive 

members is b and b = ai, then the n-th term of 

the sequence is given by: 

an = ai + (n – 1) ai (2) 

and the sequence is: 

pm (1) = ai ; pm (2) = ai + d ; 

pm (3) = ai + 2d… .. pm (n) = ai + (n-1)d (3) 

wherein d the sum of differentiated D2 cells is 

and d = pm (1) 

Based on the multicellularity of inoculating 

population, consisting of self renewing and quiescent 

cells at the time of passaging, the inoculum 

can be described as follows: 

ai = Σ (D1 n + D2 1→n ) : x , (4) 

where “n” is the number of cell generation in the 

preculture, D2 1→n is the size of the quiescent 

reservoir and “x” is the dilution factor used passaging 

the inoculum. The new self renewing QD 

line (QD-SRL) in the subculture replenished by 

reactivated QD-cells. The size of the QD-SRL 

remains constant only if x = n+1, as happened 

in the case of the cyst free subpopulation in Fig. 

1. However the TD6 LT shrinks to 25% as it has 

no vegetative reservoir which could prevent the 

reduction by reactivation. The D2 cells of the 

precyst-producing subpopulation converted to 

cyclic encystment and a vegetative reservoir no 

longer exists. If x> (n+1), the TD6 LT shrinks 

even further, and the distance to the QD24 LT is 

even greater. In the case of the new self renewing 

TD cell line 

ai = D1 n : x (5) 

Continuous and non-continuous self renewing 

cell lines. As seen in Fig. 1 the diffe - 

rentiated D2 cells of the cyst-free subpopulation 

exit the cell cycle in a reversible state and remain 

in a quiescent state (QD cells) as long as 

appropriate inducers for reactivation QD cells 

are lacking. Thus, the differen tiated D2 cells 

exiting cell cycle build a quiescent cell compartment 

(QD cell reservoir) and remain for an extended 

time mitotically repre ssed (Fig.1: t4 - 

t124) keeping phagocytic ability. In other words, 

the self-renewing line of the cyst-free subpopulation, 

comprising D1 cells, produces continuously 

differentiated QD cells. The continuous 

self renewing line from the LT cultures was 

named in the following QD LT . 

The differentiated D2 cells of the cyst-containing 

subpopulation exit cell cycle in an irreversible 

state commited for terminal diffe rentiated 

(TD cells). In the case of E. invadens terminal 

differentiated cells are progammed for 

further differentiation, coupled with the immediate 

formation of cyst wall (CE cysts). In other 

words commited TD cells are pre-cysts stages 

of E. invadens. The self-renewing line TD LT has 

a limited life span ending at t28, when regressing 

hypoxia stops its proli feration. Because cyst 

production discontinued in some passages the 

self-renewing line TD LT seemed to be a non-continuous 

SRL closing by low hypoxic conditions. 

Average generation time. The average generation 

time (AGT) of both SRLs in Fig 1 was 

30


different, indicating different cell lines with cell 

cycles of different length. While the self renewing 

line producing terminal differentiated cells 

has an accelerated AGT of about 6 h (TD6 LT 

line), the self renewing line producing quiescent 

cells showed an increased AGT of approximately 

24 h (QD24 LT line). According to the li - 

terature the extension of the cell cycle is caused 

by lengthening the G1 phase (slow cycling) and 

changes in the length of G1 phase are understood 

to accompany differentiation [26]. 

DISCUSSION 

In contrast to the results observed with axenic 

culture media, the Aa(Sm) hypoxic technique 

allows the observation of details of the 

cell cycle and differentiation in E. invadens not 

possible previously. Hypoxia is a state of oxygen 

deficiency in the Aa(Sm) culture sediment, 

induced by oxygen consumption by the metabolically 

repressed A. aerogenes bacteria. It is a 

condition in which the oxygen content of the 

culture sediment decreased below the normal 

level of the oxygen dissolved in culture medium. 

The streptomycin-erythromycin combination inhibits 

the bacterial growth resulting in a nonproliferating 

bacterial biomass, which still 

consumes oxygen. Because cultures are not 

shaking only diffusion from the surface can replenish 

the oxygen consumed by the culture se - 

diment from the bottom of the culture vessel. 

When sediment bacteria are phagocytized by E. 

invadens, the number of bacteria decreases progressively 

and hypoxia is slowly reversed. 

Most amoebic species are bacteriophilic and 

bacteria are their most important prey. Free-living 

amoebae, such as Acanthamoeba, feed as a 

motile grazer, on bacteria tightly associated with 

surfaces.. This can be viewed in culture were 

amoebae attached firmly on the base of culture 

dishes amid dense biofilms of bacteria [27]. Undoubtedly, 

the protists encounter anaerobic conditions 

in the vicinity of densely packed biofilms 

of bacteria consuming oxygen [28]. Inside the 

films living bacteria develop pronounced oxygen 

gradients forming anoxic microniches [29]. 

Ecologists have assumed the metabolic activity 

of bacteria would reduce oxygen levels in amoebic 

environments. Strains of Acanthamoeba 

grew well under aerobic and microaerophilic 

conditions as well as at hypoxic oxygen concentrations. 

Environments of 26% O2 saturation 

(2mg/L) were considered aerobic, environments 

of 11 % microaerophilic. Most of the tested 

strains grew faster under low oxygen conditions 

[27, 30]. 

Similar results were reported by Bracha and 

Mirelman [4] who found that both microaerobic 

conditions and attachment of opsonized bacteria 

at the surface of E. histolytica augment amoebic 

metabolism (virulence). For increasing the virulence 

axenic growth amoebae were preincubated 

2.5 x 10 5 amoebae/ml at a ratio of 1:1000 

with bacteria capable of adhering to the trophozoites. 

Best stimulation was obtained when 

preincubation lasts 15 min to 1 h. In this time 

60-70 bacteria attached per amoeba but only 5 - 

10 of them were ingested. We hypothesized first 

that the bacterial adherents seen by Bracha and 

Mirelman [4] consume oxygen at the surface of 

amoebae, as happened in free-living Acanthamoeba 

and considered surface hypoxia as 

the most important stimulus for changing amoebic 

behaviour. Secondly the preconditioning 

phase of 15 - 60 min is likely to correspond to 

the initiation phase of the Aa(Sm) culture and 

the increasing hypoxia which occurs in the early 

initiation phase (0 – 120 min). 

As opposed to axenic culture media, the 

Aa(Sm) technique enables solving details of 

amoebic cell cycle and differentiation. E. inva - 

dens shows a preference for low oxygen levels 

and hypoxic environments permit multicellula - 

rity in the Aa(Sm) culture. Like free living 

amoebae E. invadens grew faster under low 

oxygen conditions (see TD6 LT line). Its optimal 

AGT is about 6 h. 

Hypoxia dynamics seemed to be the driving 

force for E. invadens behaviour. In Aa(Sm) sedi - 

ments consumption of oxygen by bacteria and 

depletion of bacteria by phagocytosis control 

environment dynamics and the fate of the amoebic 

population. Due to the large number of bacteria 

at the beginning of growth, the oxygen 

depletion in the culture sediment is quite high, 

but at the end of growth phase I, when enough 

bacteria are consumed, hypoxia is relieved as 

31


oxygen levels slowly increase. Reversing hypoxia 

repressed TD6 LT proliferation at the 

growth phase I to growth phase II barrier. The 

nearly pure amoebae sediment at the end of the 

growth phase II loses the protection of the oxygen 

consuming bacteria and stops proliferation 

of QD24 LT . The environmental changes which 

occur in the Aa(Sm) culture, accurately mimic 

the events present in the natural habitat. 

Hypoxic cultivation of E. invadens in conditions 

of increasing and decreasing hypoxia 

modulated by both culture sediment partners 

lead to co-existing subpopulations comprising 

distinct cell types. Following the pattern of proliferation, 

we identified in the passage in Fig. 1 

a major cyst-free subpopulation (≤ 98%) and a 

minor cyst-containing subpopulation (≥ 2%), 

which are due to the differing counts of self renewing 

lines present. The SRL control the pro - 

cess of differentiation within each subpopulation. 

Each SRL is a constant, invariable quantity 

of cells, from which asymmetric cell divi - 

sions are always able to renew themselves 

through D1 daughter cells. Others, however, to 

produce specifically differentiated D2 daughter 

cells. 

The question is why the major cyst-free subpopulation 

is dominant with >90% of the population 

and the precyst-producing subpopulation 

is so much lower at 2 percent. Looking at the 

formulas (4) and (5) the new SRLs in mixed 

subcultures are 

Σ (D1 n + D2 1→n ) : x, for the QD-SRL and 

D1 n : x, for the TD-SRL. In the case of the Fig.1 

the size of the QD-SRL remains constant if n = 

3 and x = 4, however the TD-SRL shrinks to 

25% as it has no vegetative reservoir which 

could prevent the reduction. If x> 4 or n ≠ 3, the 

TD6 LT shrinks even further, and the distance to 

the QD24 LT is even greater. The data suggest 

that production of CE cysts in subsequent subcultures 

can only happen with the participation 

of the third metacystic subpopulation and its 

conversion of a new TD-SRL. 

Multicellular communities composed of 

various cell types were seldom reported in vitro. 

It is interesting that Goldman and Davies [31] 

described a significant and consistent bimodal 

size distribution in cultures of E. histolytica 

grown monoxenically with Trypanosoma cruzi 

in sealed low oxygen cultures. The relative sizes 

of big (B) and small (S) subpopulations continued 

in different media. The measurements of the 

authors over a time period of 1.5years showed 

that “S” and “B” clones maintain the same relative 

percentage. A switch of S and B strains was 

not observed. The authors concluded that an endogenous 

mechanism controlled size and the 

only factor capable of influencing size were 

from external factors as the medium composition 

and the bacterial culture. The same authors 

reported that in axenic cultures the amoebae 

grew only at a large size. 

This raises the following question; do the 

multicellularity and the size differences observed 

by Goldman and Davies [31] correspond 

to the “magna” and “minuta” cell types seen in 

in vivo? Do asymmetric division and multicellularity 

exist in axenic cultures? Does a minor 

axenical subpopulation producing commited 

precysts exist in axenic cultures? Are cyst like 

structures (CLS), differentiated from axenically 

grown amoebae [50, 51], as the expression of an 

incomplete miscarried diffe rentiation, due to the 

lack of appropriate hypoxic conditions? Is 

“spontaneous” encystment, as seen occasionally 

in cultures, the product of cyclic encystment 

(CE cysts) or the result of a direct conversion by 

unfavorable environmental conditions (noncyclic 

encystment, DI cysts)? 

“Magna” represents the feeding form of E. 

histolytica (E.h.: 20-30μ), living in the submucous 

layer of the large intestine and other host’s 

tissues and organs while “minuta” (E.h.: 12- 

15μ) is the non-feeding form without vacuoles 

(precyst), inhabiting in the lumen of the large intestine. 

Other authors have seen the “minuta” 

form phagocytized in the endoplasm, indicating 

“minuta” are, at least in early phases, a feeding 

form also. When resistance of the host’s body 

was low “minuta” converted to “magna” and invaded 

the tissue of the intestine [32]. The conditions 

leading to this conversion are not 

understood [33]. Bacterial infections, alterations 

in the normal bowel flora and the presence or 

absence of distinct intestinal flora were suggested 

as facilitating the conversion. Generally, 

it is accepted that “minuta” may be the primary 

32


form of E. histolytica with encysting capabilities 

in the intestinal lumen. 

This morphologically based terminology 

appears quite ambiguous. It does not distinguish 

between distinct “minuta” forms, such as between 

the primary feeding- minuta that phagocytizes 

bacteria and the precyst- minuta 

(non-feeding form). “Minuta” is rather a collective 

term used for several cell biologically distinct 

cell types observed to date, which does 

account for differences in function. This also applies 

to the “magna” concept used probably for 

all cell types of the cyst free subpopulations. 

Both collective terms are not well suited to describe 

the cell biological processes in the genus 

Entamoeba. 

The terminology used in this study is based 

in cell biology and has an interdisciplinary character. 

It allows comparisons between the differentiation 

of higher and lower eukaryotes, such 

mammalia and protists. We try in the following 

to keep a semantic correlation between the two 

terminologies to provide an acceptable terminolgy 

for both communities of developmental 

biologists and protozoologists. Correspondingly, 

the Aa(Sm) culture contains two subpopulations 

of E. invadens: a subpopulation of magna-like 

cells without encystment ability in culture and 

a subpopulation of minuta-like cells producing 

cysts by cyclic encystment. The engine of the 

cyst-free subpopulation (magna-like) in Fig. 1 

is the more ubiquitous self renewing line 

QD24 LT , which proliferates in the upper, middle 

and lower hypoxic ranges (growth phases I and 

II). In contrast to the self renewing D1 cells with 

an AGT of 24 h, quiescent D2 cells survive up 

to 5 days in the Aa(Sm) culture. During the 

growth phase (4 to 128 h) QD cells phagocytose 

constantly and increase their size to 50-60μ and 

more. Perhaps the phagocytical QD cells survive 

in vivo indefinitely, if they occupy niches of re - 

latively luxurious environmental conditions. It 

remains to be clarified in the future, whether 

quiescent QD-cell is the cell form penetrating 

various host’s tissue and organs, where they remain 

mitotically repressed or become reactivated 

for cell cycle reentry and formation of 

new SRL. 

The motor of the precyst-producing sub - 

population (minuta-like) is the more hypoxic 

TD6 LT line, which has a 6 h generation time on 

average. Produced by asymmetric cell divisions, 

they have two cell types; a D1 daughter cell identical 

to itself by self renewal and a differentiated 

short-living daughter cell D2 (precyst). Immediately 

after the division of the mother cell, D2 

daughter becomes the protecting cyst wall and 

differentiate to a resting tetranucleated cell by a 

process of terminal differentiation corresponding 

to a totipotent developmental progenitor 

differentiation. Its excysted progeny (eight 

amoebulae) generate a primary metacystic cell 

line. The conversion of a terminal differentiated 

precyst into a walled cyst during late initiation 

phase of the culture lasts about only 120 minutes. 

Precysts have a minimum life span. It was therefore 

difficult to morphologically identify in the 

mass of the remaining cell units (> 98%) (Fig. 1). 

They can be detected only through indentifying 

the final product, namely the walled cyst. 

Whether the easily detectable non-feeding minuta 

from the intestinal lumen and the extremely 

short-living terminal differentiated D2 precyst 

from the Aa(Sm) culture are one and the same 

can be questioned. Rather, it could be in the 

classical terminology the around 6 h living self 

renewing D1 cell, that is easier to find. 

The discovery of cyclic encystment and CE 

cysts in hypoxic cultures of E. invadens sheds 

light on the question of the causes and mechanisms 

of “spontaneous encystment”. Models 

lacking experimental validation led to conclusions 

that spontaneous cyst formation occurred 

in E. invadens, at the late growth phase just before 

cells reaching stationary phase, and ending 

by lysis [34]. Other authors reported that trophozoites 

of E. invadens encyst spontaneously in 

the LG media when glucose is absent [35]. 

Many researchers concluded, the molecular 

mechanisms leading to formation of cysts in cultures 

of Entamoeba remained unresolved [35- 

39]. This is especially the case for the 

connection between DNA synthesis, cell division 

and formation of cysts [40-43]. One specific 

unanswered question was why conversion 

of one or both of the daughter cells into cysts requires 

prior DNA synthesis events. Since little 

was known about the molecular mechanisms of 

primitive eukaryotes and their connections to 

33


cyst conversion, isolated observations could not 

be interpreted satisfactorily and encystment was 

considered erroneously as a multiphase process 

requiring its own DNA synthesis phase [44, 45]. 

In complex xenic media containing non-repressed 

bacterial commensals “spontaneous” 

encystment of E. histolytica was induced by the 

natural environmental conditions of the culture. 

Byers et al. [35] suggested that production of 

cysts in Entamoeba is regulated in part by the 

level of short-chain fatty acids SCFA made by 

the bacterial population of the colon and the 

composition of the mucus layer. Singh and 

Ehrenkaufer [46] concluded that components of 

the complex xenic media are sufficient to trigger 

developmental conversion of Entamoebae 

tropozoites to cysts and at least in long term cultures 

of E. invadens, parasites appear to cycle 

between cysts and trophozoites. However, most 

long term axenized populations of E. histolytica 

were not able to re-adapt to complex xenic 

media with bacteria and all axenized strains lose 

encystation competence. Attempts to reculture 

axenic grown E. histolytica with bacterial flora 

were not able to restore the ability to propagate 

and make cysts [46]. 

The data above suggest that “spontaneous 

encystment” observed in complex xenic cultures 

could be due to the presence of a minor TD-SRL 

as seen in the Aa(Sm) LT culture, producing CE 

cysts. 

“Spontaneous” cyst formation as cyclic encystment 

would differ fundamentally from the 

direct conversion, induced experimentally by 

stress factors [47-49]. Axenic cultured amoebae 

growing at a large size [31] do not provide the 

conditions for developmet of a high hypoxic 

TD-SRL and lose the capacity for conversion to 

another cell type, as described by Sing and 

Ehrenkaufer [46]. 

In the subsequent work of the author the 

subject is to uncover further details of what 

leads to cyclic and non-cyclic encystment. It 

will describe environmental and hypoxic signals 

that will control the developmental events in the 

initiation phase of the Aa(Sm) culture as well as 

during reversal of the hypoxia. It will also analyze 

the factors that direct the conversion of 

cells from the cyst-free subpopulation to form 

cysts. In our experience, QD cells (D2 cells) 

need for an induced direct conversion additional 

rounds of DNA sythesis, while when SRL cells 

(D1 cells) require no additional DNA synthesis 

(unpublished data). Induced SRL cells in nonpermissive 

cell cycle stages (S, G2/M) produced 

by symmetric division two daughter cells, both 

determined to form cysts. 

ACKNOWLEDGEMENTS 

Dr. Helmut Zacharias, cell geneticist, Kiel, 

Germany, Dr. Frank Wohlrab, cell pathologist, 

Leipzig, Germany, and Dr. Eugenia Rodica 

Niculescu, microbiologist, Augsburg, Germany, 

for peer support. In addition Dr. Dennis Thomas, 

Munich, Germany, and Robert Braun, Conn. 

USA, for German-English translation. 

CV/Felowships/ Grants: 

Vladimir F. Niculescu, Starting in 1983 was 

Partner at SeroScreen GmbH in Hannover and 

Augsburg and Consultant for Infectious Diseases, 

Lab Diagnostics and Epidemiology; 

1975-1983 Clinical Virologist at the Medical 

University of Hannover (MHH); 1969-1975 

post-graduated Researcher at the Biology Institute 

III at the University of Tübingen, and Bonn- 

Konrad- Adenauer- Foundation scholar; 1964- 

1969 Cell Biologist at the Dr.I. Cantacuzino Institute 

for Microbiology in Bucharest. 

Education: 1959-1964 Master of Science in Biology, 

University of Bucharest. 

REFERENCES 

1. Diamond LS. Techniques of axenic cultivation of Entamoeba 

histolytica Schaudinn, 1903 and E. histoly tica 

- like amoebae. J. Parasitol. 1968. 54: 1047-1056. 

2. Diamond LS. Entamoeba, Giardia and Trichomonas. 

In: In vitro methods for parasitic cultivation, (Ed. A. 

E. Taylor, J. R. Baker). 1987. Academic Press, London, 

pp 1-17. 

3. Diamond LS, Harlow DR, Cunnick CC. A new 

medium fort the axenic cultivation of Entamoeba histolytica 

and other Entamoeba. Trans. Roy. Soc. Trop. 

Med. Hyg. 1978. 72: 4331- 4332. 

4. Bracha R, Mirelman D. Virulence of Entamoeba histolytica 

trophozoites. Effects of bacteria, microaerobic 

conditions, and metronidazol. J. Exp.Med. 1984. 160: 

353-368. 

5. Chang SL. Cultural, cytological and ecological observations 

on the amoeba stage of Naegleria gruberi. J. 

Gen. Microbiol. 1958. 18: 565-578. 

34


6. Mirelman D. Ameba-bacterium relationship in amebiasis. 

Microbiol. Rev. 1987. 51: 272-284 (doi: 0146- 

0749/87/020272-13$02.00/0). 

7. Chang SL. Studies on Endamoeba histolytica. V. The 

relation of oxidation reduction potentials to the growth, 

encystation and excystation of E. histolytica in water. 

Parasitol. 1946. 37: 100-112. 

8. Jacobs L. Oxidation-reduction potentials in relation to 

the cultivation of Endamoeba histolytica. J. Parasitol. 

1941. 27 (Suppl.): 31. 

9. Nakamura M. Nutrition and physiology of Endamoeba 

histolytica. Bacteriol. Rev. 1953. 17: 189-212 

(PMID: 13081544) (PMCID: PMC180769). 

10. Reinertson JW, Thomson PE. Experimental amoebic 

hepatitis in hamsters. Proc. Soc. Exp Biol. Med. 

1951. 76: 518-521 (PMID: 14844258). 

11. Troller JA. and Frazier WC. Repression of Staphylococcus 

aureus by food bacteria. II. Causes of inhibition. 

Appl Microbiol. 1962. 11: 163-165. 

12. Clifton CE. A comparison of the metabolic activities 

of Aerobacter aerogenes , Eberthella typhi and Escherichia 

coli. J. Bacteriol. 1937. 33: 145-162. 

13. Niculescu VF. A culture medium for study of the cell 

system in E. invadens. 3rd Intern. Congr. Parasit. Munich, 

ICOPA III, G3; 1974a. Published on-line. 

http://entamoebainvadens2010vfn.wordpress.com. 

14. Niculescu VF. The primitive cell system of E. invadens 

as related to cell differentiation. 3 rd Intern. 

Congr. Parasit. Munich, ICOPA III, A11; 1974b. Pu - 

blished on-line http://entamoebainvadens2010vfn. 

wordpress.com. 

15. Jacob E. Das Redoxpotential in Bakterienkulturen. 

II. Ztschr. f. Allg.Mikrobiol. 1971. 

11: 691-734 (doi: 10.1002/jobm.19710110809). 

16. Kerk NM., Feldman LJ. A biochemical model for 

initiation and maintenance of the quiescent center-implications 

for organization of root meristems. Development 

1999. 121: 2825-2833 

17. Reichelt JP. Specific checkpoints regulate plant cell 

cycle progression in response to oxidative stress. 

Plant. J. 1999. 17: 647-656. 

18. Russo T, Zambrano N, Esposito F, Ammendola R, 

Cimino F, Fiscella M, Jackman J, O’Connor PM, 

Anderson CW, Appella E. A p53 independent pathway 

for activation of WAF1/CIP1 expression following 

oxidative stress. J. Biol. Chem. 1995. 270: 

29386-29391 (doi: 10.1074/jbc.270.49.29386). 

19. Katto N, Esaka M. Changes in ascorbate oxidase 

gene expression and ascorbate levels in cell division 

and cell elongation in tobacco cells. Physiol. Plant 

1999. 105: 321-329. 

20. Vernoux T. The root meristemless1/cadmium sensitive2 

gene defines a glutathione –dependent pathway 

involved in initiation and maintenance of cell division 

during postembryonic root development. Plant Cell 

2000. 12: 97-110. 

21. Schafer FQ, Buettner GR. Redox environment of 

the cell as viewed through the redox state of the glutathione 

disulfide/glutathione couple. Free Radic. 

Biol. Med. 2001. 30: 1191-1212 (PII S0891- 

5849(01)00480-4) (PMID: 11368918). 

22. Potters G, Horemans N., Caubergs RJ., Asard H. 

Ascorbate and dehydroascorbate influence cell cycle 

progression in a tobacco suspension. Plant Physiol. 

2000. 124: 17-20 (doi: 10.1104/pp.124.1.17). 

23. Dixit R, Cyr R. Cell damage and reactive oxygen 

species production induced by fluorescence microscopy: 

effect on mitosis and guidelines for non-invasive 

fluorescence microscopy. The Plant J. 2003. 

36: 280-290 (doi: 10.1046/j.1365- 

313X.2003.01868.x). 

24. Nakamura H, Nakamura K, Yodoi J. Redox regulation 

of cellular activation. Ann. Rev. Immunol. 1997. 

15: 351-369. 

25. Moon H, Lee B, Choi G, Shin D, Prasad DT, Lee 

O, Kwak SS, Kim DH, Nam J, Bahk J, Hong JC, 

Lee SY, Cho MJ, Lim CO, Yun DJ. NDP Kinase 2 

interacts with two oxidative stress-activated MAPKs 

to regulate cellular redox state and enhance multiple 

stress tolerance in transgenic plants. PNAS. 2003. 

100:358-363 (doi: 10.1073/pnas.252641899) 

(PMCID: PMC140977). 

26. Calder A, Roth-Albin I, Bhatia S, Pilquil C, Lee 

JH, Bhatia M, Levadoux-Martin M, McNicol J, 

Russell J, Collins T, Draper JS. Lengthened G1 

Phase Indicates Differentiation Status in Human Embryonic 

Stem Cells. Stem Cells Dev. 2012. ahead of 

print (doi:10.1089/scd.2012.0168) . 

27. Cometa I, Schatz S, Trzyna W, Rogerson A. Tolerance 

of naked amoebae to low oxygen levels with an 

emphasis to the genus Acanthamoeba. Acta Protozool. 

2011. 50: 33-40. 

28. Turner NA, Biagini GA, Lloyd D. Anaerobiosis induced 

differentiation of Acanthamoeba castelanii. 

FEMS Microbiol. Letters. 1997. 157: 149-153 (doi: 

10.1111/j.1574-6968.1997.tb12766.x). 

29. Kuhl M, Rickelt RF, Thar R. Combined imaging of 

bacteria and oxygen in biofilms. Appl.Environ.Microbiol. 

2007. 73: 6289-6295 (doi: 10.1128/AEM.01574- 

07). 

30. Barbeau J, Buhler T. Biofilms augment the number 

of free-living amoebae in dental unit waterlines. Res. 

Microbiol. 2001. 152: 753-760. 

31. Goldman M, Davis V. Isolation of different-size substrains 

from three stock cultures of Entamoeba histolytica, 

with observations on spontaneous size 

changes affecting whole populations. J Protozool. 

1965. 12: 509-523 (doi: 10.1111/j.1550- 

7408.1965.tb03250.x). 

32. Kotpal RT. Entamoeba histolytica. In: Modern textbook 

of Zoology: Invertebrates. 2010. 2.nd.ed, chap.7, 

pp 72-78 (Ed. Rakesh Kumar Rastogi). Capital Offset 

Press New Delhi. 

33. Stein E. Anorectal and colon diseases. Amoebiasis, 

pp 496-499 In: Textobook and color atlas of Procto - 

logy. 2003. 4th ed. Springer Verlag Berlin, Heidelberg. 

34. Vazquezdelara-Cisneros LG, Arroyo-Begovich M. 

Induction of encystation of Entamoeba invadens by 

removal of glucose from the culture medium. J. Parasitol. 

1984. 70: 629-633 (http://www.jstor.org/stable/3281741). 

35. Byers J, Faigle W, Eichinger D. Colonic short-chain 

fatty acids inhibit encystation of Entamoeba invadens. 

Cell.Microbiol. 2005. 7: 269-279 (doi: 

10.1111/j.1462-5822.2004.00457.x). 

35


36. Kumagai M, Makioka A, Ohtomo H, Kobayashi S, 

Takeuchi T. Inhibition of encystation of Entamoeba 

invadens by aphidicolin. Tokai J. Exp. Clin. Med. 

1998. 23: 313-317. 

37. Satish S, Bakre AA, Bhattacharya S, Bhattacharya 

A. Stress-dependent expression of a polymorphic, 

charged antigen in the protozoan parasite Entamoeba 

histolytica. Infect. Immun. 2003. 71: 4472–4486. 

38. Ebert F, Bachmann A, Nakada-Tsukui K, Hennings 

I, Drescher B, Nozaki T, Tannich E, Bruchhaus 

I. An Entamoeba cysteine peptidase specifically 

expressed during encystation. Parasitol. Int. 2008. 57: 

521-524 (doi: 10.1016/j.parint.2008.07.002). 

39. Marien D. Mechanisms of encystation of Entamoeba 

invadens. Published online. 2010 (doi:10.1371/journal.pntd.0000607). 

40. Balamuth WJ. Effects of some environmental factors 

upon growth and encystations of Entamoeba invadens. 

J. Parasitol. 1962. 48: 101-109. 

41. Meyer DF, Morgan RJ. Evidence for a link between 

division and differentiation in Entamoeba invadens. 

J.Protozool. 1971. 18: 282-284 (PMID: 5091278). 

42. Thepsuparungsikul V, Seng L, Bailey, GB. Differentiation 

of Entamoeba: Encystation of Entamoeba 

invadens in monoxenic and axenic cultures. J. Parasitol. 

1971. 57: 1288-1292. 

43. Sirijintakarn P, Bailey GB. The relationship of DNA 

synthesis and cell cycle events to encystation by Entamoeba 

invadens. Arch. Invest. Med. (Mexico) 1980. 

11: 3-10 (Suppl.1) (PMID: 7469646). 

44. Eichinger D. Encystation in parasitic protozoa. Curr. 

Opin. Microbiol. 2001. 4: 421-426. 

45. Singh N, Bhattacharya S, Paul J. Entamoeba invadens: 

Dynamics of DNA synthesis during differentiation 

from trophozoite to cyst. Exp. Parasitol. 2010. 

127:329-333 (doi:10.1016/j.exppara.2010.08.013). 

46. Singh U, Ehrenkaufer GM. Recent insights into Entamoeba 

development: identification of transcriptional 

networks associated with stage conversion. Int. J. 

Para sitol. 2009. 39 : 41-47 (doi:10.1016/j.ijpara. 

2008.09.004.) (PMCID: PMC2648836). 

47. Balamuth WJ. Biological studies on Entamoeba histolytica. 

III. Induced encystation in several mediums, 

including an account of a new procedure. J. Infect. 

Dis. 1951. 88: 230-236 (PMID:14850747). 

48. Robinson GL. The laboratory diagnosis of human 

parasitic amoebae. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 

1968. 62: 285-294. 

49. Chayen A, Avron B, Nuchamiwitz Y, Mirelman D. 

Appearance of sialoglyco-proteins in encysting cells 

of Entamoeba histolytica. Infect. Immun. 1988. 56: 

673-681 

50. Aguilar-Diaz H, Diaz-Gallardo M, Laclette JP, 

Carrero JC. In vitro induction of Entamoeba histoly - 

tica cyst-like structures from trophozoites. Plos Negl 

Trop Dis. 2010. 4(2): e607 (doi:10.1371/journal. 

pntd.0000607). 

51. Aguilar-Diaz H, Laclette JP, Carrero JC. Silencing 

of Entamoeba histolytica glucosamine 6 phosphate 

isomerase by RNA interference inhibits the formation 

of cyst-like structures. BioMed Research International. 

2013. (doi:10.1155/2013/758341). 

36

seDIMeNTe CU BACTeRII AeROBe RePRIMATe 

MeTABOLIC eLUCIDeAZÃ LA EntamoEba invadEns 

sIsTeMUL MULTICeLULAR ŞI CICLUL De VIAÞÃ AMIBIAN 

Vladimir F. Niculescu* 

institutul de Zoologie şi departamentul de biologie iii, Universitatea din tübingen, Germania 

şi Laboratoarele sero-screen din augsburg, Germania 

ReZUMAT 

În ciuda progreselor remarcabile ale biologiei celulare din ultima vreme, fenomenele de diferenţiere 

celulară la amoebele parazite din genul Entamoeba, îndeosebi mecanismele genetice şi inducţia prin 

semnale externe din mediu, au rămas în bună parte neclarificate. Principalul motiv este utilizarea frecventă 

a mediilor de cultură axenice, care nu corespund habitatelor naturale ale acestor paraziţi. Mediului 

axenic îi lipsesc activatorii şi represorii exogeni, existenţi în habitatele naturale. Majoritatea 

cercetătorilor au pierdut din vedere rolul major şi de neînlocuit pe care bacteriile comensale îl au în 

reglarea şi controlul ciclului de viaţă al amibelor parazite. În studiul de faţă am reintrodus în mod controlat 

beneficiile bacteriene. În mediul de cultură numit Aa(Sm) rolul principal îl au sedimentele de 

Aerobacter aerogens reprimate cu antibiotice, care consumă oxigenul dizolvat în mediu. Sedimentele 

bacteriene au fost inoculate cu celule vegetative sau chişti de Entamoeba invadens. Bacteriile din sediment 

furnizează anturajul hipoxic necesar, care induce şi controlează fenomenele de diferenţiere celulară 

la E. invadens. La rândul lor amibele modifică starea de hipoxie prin consumarea bacteriilor din 

sediment. Activatorii exogeni sunt în acest mod suprimaţi. Acest model de feedback comensal controlează 

dezvoltarea şi diferenţierea amibelor în cadrul ciclului lor de viaţă. Pentru prima dată au putut fi 

identificate in vitro populaţii complexe, subpopulaţii distincte şi tipuri celulare diferite, fenomen cunoscut 

la organismele unicelulare sub numele de multicelularitate simplă. Culturile Aa(Sm) de scurtă 

şi lungă durată conţin linii de celule continue şi discontinue, capabile de autoreînnoire şi diferenţiere, 

dat fiind diviziunea asimetrică ce le caracterizează. Liniile autoreproductive produc pe de o parte celule 

ce parăsesc ciclu mitotic (celule „quiescente”, QD), a căror diferenţiere este reversibilă, iar pe de altă 

parte celule diferenţiate terminal şi ireversibil (prechişti, celule TD), care evolueza ulterior la chişti. 

Noua metodă de cultură este un instrument ideal în cercetarea inter-relaţiei existente între diferitele anturaje 

hipoxice şi comportamentul multicelular al speciei E. invadens, în cadrul ciclului de viață. 

Cuvinte cheie: Entamoeba, hipoxie, diferenþiere, quiescenþã, diferenþiere terminalã, închistare ciclicã şi nonciclicã, 

conversie celularã. 

Abrevieri: LT, culturi pe termen lung, D1, D2, celule fiice neidentice rezultate din diviziune asimetricã; sRL, liniile 

de autoreînnoire, cuprinzând doar celule auto-reproducãtoare (D1); QD24 LT , TD6 LT linii de autoreînnoire, ce 

produc celule diferenþiate, în stare de repaus sau „quiescenþa” (QD) sau în starea de diferenþiere terminalã (TD); 

Ce şi DI, chişti produşi prin închistare ciclicã sau inducþie directã; Aa(sm), mediu de culturã ce conþine sedimente 

bacteriene cu aerobacter aerogenes (Aa), dupã precondiþionare cu serratia marcescens (sm). 

INTRODUCERE 

După 1968, mediul axenic TPS-S-1 şi variantele 

BI-S-33, S-TYI-33 [1-3] au devenit extrem 

de populare. Mulţi cercetători au decis să 

utilizeze culturile fără bacterii, fiind cele mai 

avantajoase pentru studiile moleculare şi genetice, 

fără a lua în considerare faptul că aceste 

culturi axenice nu sunt potrivite pentru studiul 

*autor corespondent: Vladimir Florin Niculescu, D-86420 Diedorf, Germania, Kirschenweg 1; 

e-mail besnea@aol.com (principal) sau Vladimir.Niculescu@yahoo.com 

37


biologiei celulare la genul Entamoeba. Aspecte 

importante privind ciclul celular şi diferenţierea 

au rămas neclare, deoarece în culturile lipsite de 

bacterii, lipsesc semnalele vitale, existente în 

micro-nişele simbiotice din organismul parazitat. 

Trăsături fiziologice importante, cum ar fi 

virulenţa, regresează în culturile axenice [4]. 

Culturile axenice utilizate pe scară largă în ultimii 

45 de ani au dus la stagnarea cunoştinţelor 

privind ciclul de viaţă al genului Entamoeba, dat 

fiind cultivarea în condiţii mult prea diferite faţă 

de habitatul natural. 

În culturile xenice, bacteriile vii susţin creşterea 

amibelor, în timp ce bacterii inactivate termic 

au efect contrar [5-6]. Mirelman [6] a 

investigat problema aportului bacterian în culturile 

xenice. Una dintre ipoteze susţine că bacteriile 

anaerobe oferă condiţii sau potenţial 

redox adecvat pentru amibe [7-9]. O altă teorie 

sugerează că anumite produse ale metabolismului 

bacterian sunt esenţiale pentru amibe [10]. 

Bracha şi Mirelman [4] au arătat că, cultivarea 

prelungită a E. histolytica in condiţii axenice 

a scăzut virulenţa acesteia, în timp ce 

ca pacitatea amibei de a provoca leziuni creşte 

semnificativ după o asociere intimă cu bacterii 

naturale sau opsonizate. Autorii sunt de părere 

că, prin contactul intim de suprafaţă cu amibele, 

bacteriile stimulează sistemul de transport de 

electroni. Rezultate similare au fost obţinute în 

medii cu conţinut de oxigen scăzut, utilizând o 

atmosferă de azot, căreia i s-a adăugat 5% O2 şi 

10% CO2. 

Scopul primar al studiului nostru a fost de a 

îmbunătăţi metoda de cultură monoxenică prin 

modificări în beneficiul studiilor de biologie celulară. 

Am căutat să prevenim multiplicarea daunătoare 

a bacteriilor în cultura monoxenică prin 

antibiotice dizolvate în mediu, oferind pe de altă 

parte amibelor produse de metabolism bacterian, 

recoltate în prealabil, şi bacterii suprimate metabolic. 

Am asigurat prin centrifugare usoară 

contactul intim de suprafată între amibe şi bacterii. 

În acest scop, amibele au fost inoculate şi 

crescute în sedimente comune cu bacterii consumatoare 

de oxigen. Am căutat să identificăm 

tulpini bacteriene optimale pentru acest nou sistem 

de cultură și am ales în final S. marcescens 

(Sm) pentru precondiţionarea mediului de cultură 

şi A. aerogenes (Aa) ca particulă fagocitabilă 

şi consumatoare de oxigen. 

Am emis ipoteza că interacţiunea dintre 

bacteriile consumatoare de oxigen şi amiba fagocitară 

ar modifica continuu starea hipoxică a 

sedimentelor din cultură. Este cunoscut faptul 

că bacteriile gram-negative, cum ar fi A. aerogenes, 

au nevoie de oxigen pentru a supravieţui 

şi a creşte, iar biomasa bacteriană consumă oxigen, 

chiar şi în faza staţionară. Conţinutul de 

oxigen într-o cultură logaritmică de A. aerogenes 

scade zilnic cu o rată continuă, şi anume de 

la aproximativ 248 Eh / aerobioză mV până la 

-205 unități / mV anaerobioză [11]. Valorile 

pH-ului culturii se schimbă de la 6,8 la 5,2. La 

sfârşitul fazei de creştere logaritmică rata consumului 

de oxigen scade până când se ajunge la 

o valoare redusă şi constantă [12]. 

În prima parte a lucrarii de faţă se descrie 

metodologia cultivării amibelor în sedimente hipoxice 

intreţinute de A. aerogenes. În partea a 

doua a studiului am urmărit cultura şi stimulii 

externi ce controlează ciclul mitotic şi diferenţierea 

celulară, în timp. Culturile paralele au fost 

evaluate o singură dată sau în mod repetat. S-a 

reuşit caracterizarea unor subpopulaţii distincte 

de celule, neobservate în mediile axenice. Primele 

observaţii în această direcţie au fost publicate 

de autor în mod succint, cu mulţi ani în 

urmă [13,14], dar interpretarea datelor a ramas 

dificilă, dat fiind nivelul limitat al cunostiinţelor 

de biologie celulară din acel timp. 

Evaluările cantitative necesită omogenizarea 

tuburilor de cultură prin agitare prealabilă, 

ceea ce duce la disturbarea condiţiile hipoxice, 

existente în sediment. Sedimentele omogenizate 

pot fi refăcute prin centrifugare, şi proliferarea 

E. invadens continuă. Există însă diferenţe ulterioare 

faţă de evoluţia culturilor neevaluate. 

Omogenizarea prin agitare este în fond un proces 

de aerare bruscă, care modifică condiţiile hipoxice 

din sediment, restabilind potenţiale redox 

oxidative [15]. Stresul oxidativ conduce în general 

la efecte negative, cum ar fi inhibarea creşterii 

sau moartea celulelor [16-20], sau perturbă 

homeostazia şi valorile redox intracelulare [21], 

ceea ce împiedică proliferarea mitotică [22, 23]. 

Ocazional însă stresul oxidativ poate avea şi 

efecte pozitive, cum ar fi activarea celulelor şi 

proliferarea lor [24-25]. 

38

Sisteme multicelulare la eucariotele primitive 

MATERIALE ŞI METODE 

Organisme 

Tulpina TR2 / 1 de E. invadens (Madagascar) 

a fost obţinută de la Douglas Cameron Barker, 

Departamentul de Zoologie, Universitatea 

din Edinburgh, Scoţia. Această tulpină este uşor 

de manipulat în condiţii experimentale. Dintrun 

număr de 20 de tulpini bacteriene furnizate 

de Institutul de Igienă, Universitatea din Tübingen, 

au fost alese S. marcescens pentru precondiţionarea 

mediului de bază şi A. aerogenes, 

tulpina AH8, drept coparticipant, în sedimentele 

mediului de cultură Aa(Sm). 

Mediul de bază (MB) 

Soluţiile stoc folosite la prepararea mediului 

de bază MB au fost: (a) ser bovin 10% în apă 

distilată, autoclavat (121°C, 10 min) şi apoi stocat 

la rece timp de mai multe zile (


Inoculul şi starea de hipoxie în cultura 

Aa(Sm) 

Cultivarea are loc în tuburi de sticlă pentru 

centrifugă cu baza în U de 10 ml care conţin 

5 ml de MC, în care se inoculează 5 mg de 

A. aerogenes AH8 şi 0,5 sau 1,0 x 10 6 amibe. 

Chiştii inoculaţi în cultura Aa(Sm) dechisteaza 

ca amibe vegetative. După adăugarea inoculanţilor, 

tuburile au fost centrifugate la 1000 rpm 

pentru a forma un sediment uşor solid pe fundul 

tubului şi se incubează la 28°C. Masa bacteriană 

sedimentată pe fundul tuburilor de cultură consumă 

oxigenul dizolvat în coloana de lichid şi 

formeză un gradient. În sediment se instalează în 

scurt timp o stare hipoxică, care descreşte odată 

cu fagocitarea bacteriilor consumatoare de oxigen. 

Mediul de cultură rămâne pe toată durata 

creşterii amibelor clar şi transparent. Suprainfecţiile 

bacteriene fiind producătoare de opacitate 

pot fi uşor detectate şi îndepărtate. Toate experimentele 

au fost efectuate în condiţii sterile. 

Analiza cantitativă şi efectele ei colaterale 

Mărimea populaţiilor amibiene a fost determinată 

cu o cameră de numărare hematologică, 

sub microscop. Conţinutul tuburilor de cultură 

a fost omogenizat în prealabil, prin agitare mecanică, 

barbotare şi aerare, utilizând o pipetă 

sterilă 2 ml din sticlă. Prin acest procedeu se 

modifică valorile potenţialului redox de pe fundul 

tubului de cultură şi, implicit, starea de hipoxie. 

Amibele, scoase din sediment şi 

sus pendate în coloana de lichid, sunt confruntate 

pentru scurt timp cu semnale oxidative. După 

prelevare, sedimentele de cultură au fost recuperate 

prin centrifugare. Pentru a minimiza impactul 

asupra cineticii populaţiei, au fost 

demarate mai multe replici, în paralel, fiecare 

dintre ele fiind examinată doar o singură dată şi 

apoi aruncată. 

REZULTATE 

Am cultivat E. invadens timp de mai mulţi 

ani de zile în sedimente cu A.aerogenes prin metoda 

Aa(Sm). Pe parcursul unei perioade de 

patru ani, am examinat peste 100 de pasaje în 

culturi de lungă durată (LT). Rezultatele au arătat 

că bacteriile consumatoare de oxigen furnizează 

condiţii hipoxice optimale pentru 

proli ferarea şi diferenţierea celulară la E. invadens. 

Cercetări premergătoare au stabilit că E. 

invadens preferă în cultură nivele scăzute de 

oxigen şi bacterii opsonizate. Aminoglicozidele, 

cum ar fi streptomicina şi macrolidele, cum ar 

fi eritromicina, inhibă în cultură sinteza de proteine 

şi proliferarea A. aerogenes, fără a dăuna 

populaţiei amibiene. Avantajele culturilor 

Aa(Sm) sunt semnalele hipoxice induse de bacteriile 

consumatoare de oxigen şi dinamica hipoxică 

ce rezultă din interacţiunea bacteriilor 

reprimate cu amibele fagocitare. E. invadens 

consumă bacteriile, reducând starea de hipoxie 

din vecinatatea amibelor (anturajul hipoxic). 

Consumul de oxigen iniţializat de către bacterii 

şi consumarea bacteriilor de către E. invadens 

controlează creşterea şi dezvoltarea sistemului 

celular la E. invadens. 

Consumul rapid de oxigen la începutul cultivării, 

atâta vreme cât masa bacteriană rămâne 

în bună parte intactă, face ca amibele pasajate 

să-şi termine în timp scurt ciclul celular şi să 

intre in diviziune. Pe parcursul cultivării, atunci 

când populaţia amibiană consumă din ce în ce 

mai multe bacterii consumatoare de oxigen, starea 

hipoxică se inversează. Spre deosebire de 

mediul ambiant din culturile axenice, modificările 

hipoxice din cultura Aa(Sm) imită semnalizările 

extracelulare şi anturajul redox din 

habitatele naturale. 

Un exemplu reprezentativ pentru culturile 

de lungă durată, il oferă populaţia din Fig. 1, urmarită 

pe o perioadă de 96 h. Valorile cinetice 

din Fig. 1 arată evoluţia subpopulaţiilor, fazele 

de creştere şi produsele de diferenţiere celulară. 

Faza de iniţiere a culturii (0-4 h) * . Faza de 

iniţiere a culturii începe în momentul t0 şi se termină 

la t4, atunci când populația amibiană s-a 

dublat. În prima parte a fazei de iniţiere (0-2 h), 

oxigenul din sedimente este consumat rapid de 

către bacterii. Activatorii mitotici externi determină 

toate celulele inoculate - indiferent de faptul 

dacă acestea se găsesc în faza G1 şi sunt 

active mitotic, sau în faza G0, ca celule inerte, 

respectiv ”quiescente” (QD) - să reintre şi să 

continue ciclul celular. În ultima parte a fazei de 

iniţiere (2-4 h) celulele termină ciclul şi intră în 

diviziunea asimetrică. 

* 

Valori medii 

40


t0 t4 t30 t72 t96 

initiation growth I growth II pre-stationary stationary 

3,5 

3,0 

2,5 

2,0 

1,5 

1,0 

0,5 

c 

v 

c 

v 

c 

v 

c 

v 

c (cysts) 

v (vege-tative cells) 

t 0 24 48 72 96 

c( x 104) 0.60 3.00 3.50 3.45 3.50 

v( x 106) 0.50 1.08 1.54 2.04 2.01 

Ratio(%) 1.20 2.77 2.27 1.69 1.74 

Ratio=c/v 

Fig. 1 - TD6 LT și QD24 LT în cultura de lungă durată producătoare de chiști la E. invadens 

Pasaj din cultura amibiană 

F 

de lungă durată (LT) cu 5 ml sediment bacterian şi 5 ml supernatant, inoculat cu un amestec de 

celule diferite, din pasajul precedent. După faza de iniţiere, linia QD24 LT porneşte proliferarea cu 0,5 x 10 6 celule, linia 

TD6 LT cu 0,6 x 10 4 celule. La 72 h după inoculare, noua populaţie conţine 2,0 x 10 6 celule vegetative (cca 98%) şi 3,5 x 

10 4 celule închistate (chişti). Celulele vegetative nu închistează şi intră în faza de apoptoză (t120-t144), în măsura în care 

nu sunt re-pasajate la timp (t96-t120). Raportul chişti: celule vegetative variază de la 2,77% (t24) la 1,69% (t72), dată 

fiind dinamica diferită a celor două linii cellulare. 

Faza primară de proliferare (5 - 30 h)*. 

Este faza în care o subpopulaţie permisivă produce 

succesiv chişti. Fracţiunea chiştilor crește 

printr-un număr limitat de diviziuni succesive, 

şi anume în progresie aritmetică (C, 2C, 

3C....nC). Producţia de chişti încetează la circa 

28 - 30 ore după inoculare, find reprimată de 

scăderea hipoxiei. Acest punct de barieră marchează 

trecerea de la faza 1a de creştere, ce are 

loc în condiţii de hipoxie mai accentuată, la faza 

2a, cea cu hipoxie mai scăzută. 

Faza târzie de proliferare (30-72 h)*. În 

această fază continuă să prolifereze doar subpopulaţia 

vegetativă - neproducatoare de chişti - 

consumând în continuare bacterii şi reducând 

astfel, în mod continuu, starea hipoxică din cultură. 

La sfârşitul acestei faze, circa 80% din celule 

sunt ieşite din ciclul celular, repauzând în 

G0. Sunt celule mitotic-inerte sau ”quiescente” 

(QD), ce păstrează capacitatea de fagocitare. 

Faza prestaţionară (72-96 h)*. În această 

fază, diviziunile celulare sunt rare. În unele cazuri, 

nedescrise în lucrarea de faţă, s-au observat 

pe de altă parte o serie de diviziuni simetrice. 

* 

Valori medii 

Faza staţionară (97-124 h)*. În această 

fază, creşterea populaţiei sistează. În lipsa bacteriilor 

consumatoare de oxigen, celulele sunt 

supuse stresului oxidativ, fară a forma însă 

chiști. 

Moartea vegetativă începe în momentul în 

care metabolismul celular vegetativ nu mai 

poate fi menţinut. La 144 h după începerea cultivării, 

unele dintre celulele vegetative s-au lizat, 

altele se găsesc in stare de senescenţă ireversibilă. 

La recultivare, aproximativ o treime din inoculul 

în vârstă de 144 h se demaschează drept 

apoptotic. 

Subpopulaţiile. În culturile pe termen lung 

(LT) din Fig. 1, am observat două subpopulaţii 

distincte, intreţinute de catre două linii celulare 

de autoreînnoire şi diferenţiere, şi anume: (i) o 

subpopulaţie principală, neproducătoare de 

chişti, ce formează aproximativ 90-98% din totalul 

populaţiei şi (ii) o populaţie mai mică, producătoare 

de chişti, la care închistarea decurge 

în mod ciclic, după fiecare nouă diviziune. O a 

treia subpopulaţie este subpopulaţia primară, 

metachistică, generată direct după exchistare, 

care, în cultura LT din Fig. 1 rămâne cantitativ 

nesemnificativă. 

41


Liniile de autoreînnoire şi rezervoarele de 

celule diferenţiate. Cele două linii celulare ce 

domină populaţia din Fig. 1 sunt catalogate în 

funcţie de produşii lor de diferenţiere, durata ciclului 

celular şi tipul de cultură. Linia producătoare 

de chişti este TD6 LT , iar linia 

ne pro du cătoare este QD24 LT . După fiecare diviziune 

asimetrică 50% din celulele fiice rămân 

mitotic-active şi cu capacitate autoreproductivă 

(celulele D1) asigurând, pe timp scurt sau îndelungat, 

autoreînnoirea şi durata de viaţă a liniei 

celulare din care provin (SRL,”self renewing 

line”). Ambele linii TD6 LT -SRL şi QD24 LT -SRL, 

rămân în fiecare pasaj constante ca mărime. Celelalte 

50% celule surori, cele de după diviziune 

(celule D2), sunt celule diferenţiate, care rămân 

reprimate mitotic. Reprimarea mitotică este reversibilă 

la celulele QD din linia QD24 LT şi ireversibilă 

la celulele TD din linia TD6 LT . Diviziunea 

asimetrică şi ieşirea din ciclu sunt markeri 

de diferenţiere celulară. Celulele QD, oprite in 

faza G0, formează un rezervor de celule în afara 

ciclului celular, în timp ce celulele TD (pre-chiştii) 

se închistează, şi formează de fapt un al doilea 

rezervor de diferenţiere, cu rol în refacerea 

ciclului de viaţă. Aşadar, pe timpul cultivării, 

populaţia vegetativă creşte numeric numai prin 

aportul celulelor QD, dezactivate mitotic. 

Inoculul şi pasajarea culturii 

Semnalele extracelulare din faza de iniţiere 

timpurie (0-4 h) stimulează toate fracţiunile celulare 

la continuarea ciclului celular şi intrarea 

lor în diviziune. În subpopulaţia neproducătoare 

de chişti, celulele QD sunt reactivate şi transformate 

în celule de autoreînnoire. Cu alte cuvinte, 

în ciuda faptului că în momentul inoculării (t0) 

raportul dintre celulele autoreproductive şi celule 

mitotic-inerte este 1:4 (ca în Fig. 1) ori 1:5, 

ori 1:6, la sfârşitul fazei de iniţiere timpurie (0- 

2 h) noua linie QD24 LT din subcultură, conţine 

de 4, 5 sau 6 ori mai multe celule autoreproductive 

decât inoculul din momentul t0. Prin cointeresarea 

celulelor de rezervă şi reactivarea lor, 

linia autoreproductivă QD24 LT a crescut brusc 

între 400% şi 600%. La 240 min după inoculare 

(t4) tânăra populaţie s-a dublat încă o dată, dat 

fiind prin prima diviziune. În momentul t4 noile 

fracţiuni D1 și D2 sunt fiecare cantitativ la fel 

de mari ca şi inoculul pasajat în momentul t0. 

Succesiunea diviziunilor asimetrice şi 

progresia aritmetică a proliferării 

După prima diviziune, la sfârşitul fazei de 

iniţiere, subpopulaţia creşte aritmetic prin noi 

generaţii de celule diferenţiate, după formula 

pm (x) = [ pm (x+1) + pm (x-1) ] : 2 (1) 

care arată că fiecare termen din progresie 

corespunde sumei termenilor învecinaţi, luaţi pe 

jumătate. 

Dacă mărimea inoculului amibian (ai) este 

egală cu diferenţa (b) dintre două generaţii succesive 

de celule, datorită faptului ca populaţia 

creşte numai prin aportul celulelor diferenţiate 

(d) şi deci, pe de-o parte b = d, iar pe de altă 

parte b = ai şi d = pm (1) , atunci oricare termen 

din cadrul progresiei, să zicem an, poate fi transcris 

drept 

an = ai + (n – 1) ai (2) 

iar în măsura în care vrem să ne referim la 

suma totală a celulelor diferenţiate din rezervorul 

celulelor QD, progresia va fi 

pm (1) = ai ; pm (2) = ai + d ; pm (3) = 

ai + 2d… .. pm (n) = ai + (n-1)d (3) 

În situaţia în care vrem să definim mărimea 

inoculului în raport cu componentele sale celulare 

D1 si D2, ecuaţia e 

ai = Σ (D1 n + D2 1→n ) : x (4) 

unde n este sunt numărul de diviziuni asimetrice 

din cultura precedentă, D2 1→n numărul 

de celule din rezervorul QD și x factorul de diluţie, 

ce reiese din raportul cantitativ dintre populaţia 

mamă în întregimea ei şi acea parte din 

ea, folosită ca inocul pentru noua subcultură. 

Reînnoirea continuă şi discontinuă a liniilor 

SRL. Aşa cum se observă în Fig. 1 celulele 

diferenţiate QD din subpopulaţia fără chişti 

rămân într-o stare mitotic-inertă atâta timp cât 

nu există inductori adecvaţi pentru reactivarea 

lor. Ele rămân pe timp îndelungat (Fig. 1: T4 - 

t124) într-o stare de reprimare („quiescenţă”), 

devenind celule de rezervă (rezervorul QD). În 

pasajul ce urmează subculturii din Fig. 1, unde 

la momentul t72 şi t96 raportul dintre celulele 

autoreproductive D1 şi celulele de rezervă D2 

este 1:3 (n=3), linia QD24 LT va rămâne constantă 

ca mărime, dar numai în situaţia în care 

x=4. Apelarea la celulele de rezervă asigură 

reînnoirea continuă a liniei QD24 LT , la fiecare 

nou pasaj. Linia TD6 LT , care nu are celule vege- 

42


tative de rezervă, se va micşora în urma pasajului, 

în cazul x=4 reducându-se de fapt la 25%. 

Dacă însă n 4 TD6 LT se micşorează şi 

mai mult, iar valoarea raportului QD24 LT :TD6 LT 

creşte, fenomen ce explică reducerea sau dispariţia 

totală a liniei producătoare de chişti întruna 

dintre subculturile ce urmează. În alte pasaje 

linia TD6 LT a fost reînnoită, dat fiind procesele 

de dechistare necontrolată ce apar în cadrul culturii 

(reînnoire discontinuă). 

Celulele diferenţiate ireversibil (prechiştii). 

Din punct de vedere evolutiv, celulele D2 

- produse de linia TD6 LT - se află într-o stare de 

diferenţiere ireversibilă (diferenţiere terminală, 

TD). În cazul E. invadens celulele TD posedă 

rol de pre-chişti, fiind programate să continue 

diferenţierea până la celula intrachistică, reorganizată 

genomic. 

Durata medie de viaţă a celulelor de autoreînnoire. 

În timp ce celulele D1 din linia 

TD6 LT au o durată medie de viaţă de aproximativ 

6 h (AGT6), durata medie de viaţă a celulelor 

D1 din linia QD24 LT este de aproximativ 24 h 

(AGT24). În condiţiile de viaţă ale culturii din 

Fig. 1, linia TD6 LT , desfăşoară un ciclu de viaţă 

scurt şi rapid, în timp ce linia QD24 LT urmează 

un ciclu tergiversat. Potrivit literaturii, extinderea 

ciclului celular decurge din prelungirea fazei 

G1, respectiv oprirea celulelor mitotice, la un 

punct de control din interiorul sau sfârşitul fazei 

G1 [26]. 

DISCUÞII 

Starea hipoxică 

Spre deosebire de studiile în medii axenice, 

culturile hipoxice cu sedimente bacteriene dezvăluiesc 

o serie de detalii privind ciclul celular 

şi diferenţierea la Entamoebae, aspecte necunoscute 

până în prezent. Hipoxia este o condiţie deficitară 

de oxigen, indusă în sedimentele din 

cultură Aa(Sm) de către bacteriile speciei A. aerogenes. 

Oxigenul din sedimentul bacterian, în 

care au fost inoculate amibele, scade la scurt 

timp după inoculare (0-2 h), şi anume sub nivelul 

normal al oxigenului dizolvat în mediul de 

cultură. Combinaţia streptomicină-eritromicină, 

care nu afectează proliferarea amibelor, inhibă 

creşterea bacteriilor, ce funcţionează in aceste 

condiţii doar ca o biomasă neproliferativă, consumatoare 

de oxigen. Deoarece tuburile de cultură 

nu sunt agitate după inoculare, se formează 

un gradient de oxigen de la suprafaţa coloanei 

de lichid către fundul tubului, acolo unde se află 

sedimentul cu cultură amibiană. Atunci când 

bacteriile din sediment sunt fagocitate de către 

E. invadens, numărul de bacterii scade progresiv 

şi hipoxia este inversată lent către valori mai 

oxidative. 

Cele mai multe specii de amibe sunt bacteriofile, 

bacteriile constituind hrana lor de căpătâi. 

Amibele libere, cum ar fi Acanthamoeba, 

„pasc” în adevăratul sens al cuvântului „gazonuri 

bacteriene” prinse de suprafeţe fixe, comportament 

observat adesea în biofilmele 

bac teriene dense, de la baza vaselor de cultură, 

ce au fost inoculate cu amibe [27]. Fără îndoială, 

amibele se orientează către zonele de anaerobioză 

din interiorul maselor bacteriene stratificate, 

consumatoare de oxigen [28]. În interiorul 

biofilmelor, se formează adevărate gradiente de 

oxigen, cu micronişe anoxice [29]. Ecologii 

presupun ca activitatea metabolică a bacterilor 

reduce conţinutul de oxigen de la suprafaţa amibelor. 

Unele tulpinile de Acanthamoeba preferă 

condiţii aerob-microaerofile, în timp ce altele 

preferă concentraţii hipoxice. Aerobia începe în 

condiţii de saturare de ≤ 26% O2 (2 mg/l), în 

timp ce concentraţii de 11% sunt considerate microaerofile. 

Multe dintre tulpinile testate cresc 

mai repede la concentraţii scăzute de oxigen [27, 

30], ceea ce am observat şi noi, referitor la durata 

de viaţă a liniei TD6 LT , care se limitează 

doar la fazele primare de creştere (0-4 şi 5-30 

h), atunci când cantitatea de bacterii - şi implicit 

starea hipoxică - sunt cele mai ridicate. 

Date asemănătoare au fost raportate şi de 

către Bracha şi Mirelman [4], care au constatat 

că atât condiţiile de micro-aerobioză, cât şi aderarea 

bacteriilor opsonizate la suprafaţa celulelor 

de E. histolytica ridică metabolismul amibian şi 

virulenţă. Pentru a stimula virulenţa tulpinilor 

crescute axenic, autorii au preincubat 2,5 x 10 6 

amibe/ml cu bacterii capabile să adere la suprafaţa 

trofozoiţilor, şi anume în raport de 1:1000. 

Cele mai bune rezultate au fost obţinute cu 

preincubări de 15-60 min, timp în care amibele 

au adunat la suprafaţa lor circa 60-70 bacterii, 

mult peste cerinţele procesului de endocitoză, 

43


notat la 5-10 bacterii pe celulă. Ipoteza noastră 

prevede că bacteriile de pe suprafaţa amibei 

consumă oxigenul din mediu - atât la E. histolytica, 

cât şi la E. invadens şi Acanthamoeba – în 

beneficiul amibei. În studiul nostru am aratăt că, 

în decursul primelor 120 min după inoculare, 

0,5 - 1,0 x 10 6 amibe profită în totalitate de prezenţa 

celor 5 mg A. aerogenes, al căror efect hipoxic 

și nutritiv exacerbează metabolismul 

amibian şi activitatea mitotică. 

Spre deosebire de mediile de cultură axenice, 

utilizarea tehnicii Aa(Sm) - care imită condiţiile 

hipoxice din habitatele naturale - duce la 

o serie de noi cunoștinţe privind ciclul celular şi 

diferenţierea la amibele parazite. E. invadens 

arată o preferinţă clară pentru nivelurile scazute 

de oxigen şi stări de hipoxie. Hipoxia pare a fi 

condiţie sine qua non pentru multicelularitatea 

amibelor parazite. Una dintre liniile observate 

in Fig. 1 şi anume TD6 LT , proliferează numai în 

condiţii de hipoxie mai ridicată (0-30 h), răspunzând 

cu un ciclu celular scurt (AGT6), în contrast 

cu linia QD24 LT , care recurge în condiţiile 

de creştere din Fig. 1 la un ciclu celular prelungit 

(AGT24) şi suportă concentraţii de oxigen 

foarte diferite (0-72 h). 

Dinamica hipoxiei în culturile Aa(Sm) reprezintă 

de fapt forţa motrice care controlează 

comportamentul şi evoluţia sistemului celular la 

E. invadens. Bacteriile din sedimentele culturii 

Aa(Sm) consumă cu maximum de beneficiu 

oxigenul din anturajul amibelor, fiind consumate 

însă şi ele la rândul lor de către populaţia 

amibiană în creştere, fapt ce se răsfrânge ca replică 

asupra populaţiei amibiene, forţată să iasă 

din anumite stări de echilibru, aşa cum se întâmplă 

cu linia TD6 LT , care îşi incetează proliferarea 

(t30). Epuizarea oxigenului este destul de 

mare la începutul fazei primare de creştere, dar 

descreşte ulterior continuu, până în momentul în 

care puţinele bacterii care au mai rămas nu mai 

pot proteja amibele împotriva oxigenului în revenire. 

În consecinţă, chiar şi linia QD24 LT îşi 

opreşte la t72 proliferarea şi intră în platou. Modificările 

hipoxice, aşa cum apar ele în perioada 

t0-t72, imită în mod mimetic evenimente din habitatul 

natural. 

Multicelularitatea 

Ca o consecinţă a evoluţiei diferite a celor 

două subpopulaţii, 98% din populaţia din Fig. 1 

aparţine la sfârşitul fazei de creştere (t72) subpopulaţiei 

lipsite de chişti. Raportul cantitativ 

dintre cele două linii autoreproductive TD6 LT şi 

QD24 LT este extrem şi discrepant, chiar şi în momente 

în care ambele linii sunt proliferative. În 

momentul t24 corespund la 0,5 x 10 4 celule D1 

din linia TD6 LT , 0,5 x 10 6 celule D1 din linia 

QD24 LT , raportul fiind aşadar 1:100. Mărimea liniei 

TD6 LT se citeşte din ultima diviziune asimetrică, 

ce are loc la scurt timp după t24 şi 

diferenţa ce se observă între cantitatea de chişti 

la t48 şi la t24. 

Lucrările ce discută fenomenul de multicelularitate 

la Entamoeba sunt rare. Cu aproape 50 

de ani în urmă Goldman şi Davies [31] au descris 

la E. histolytica tipuri celulare mari (B) şi 

mici (S), şi anume în culturile monoxenice cu 

Trypanosoma cruzi, având nivel scăzut de oxigen. 

Autorii au mai găsit subpopulaţii de tip B 

si C şi în alte medii. Datele adunate pe timp de 

1,5 ani au arătat că clonele “S” şi “B” rămân 

într-un raport stabil (S:B) una faţă de alta, fără 

să apară treceri de la B la S, şi invers. Autorii au 

tras concluzia că există un mecanism endogen 

răspunzător pentru dimensiunea medie a celulelor, 

iar pe de altă parte, factori externi, ce influenţează 

fenotipul, aceştia fiind diverşi 

componenţi din mediu şi bacteriile asociate. 

Posibil ca tipurile B şi S descrise in vitro să corespundă 

formelor magna şi minuta, descrise in 

vivo. 

În concepţia clasică referitoare la E. histolytica, 

forma ”magna” este tipul amibei fagocitare, 

de aproximativ 20-30μ, care trăieşte atât în 

stratul submucos al intestinului gros, cât şi în ţesuturile 

şi organele organismului gazdă, în timp 

ce forma “minuta”, de numai 12-15μ, este forma 

lipsită de vacuole de fagocitoză, ce trăieste ca 

formă prechistică în lumenul intestinului gros. 

Alţi autori au localizat în forma „minuta” vacuole 

de fagocitoză (fagozomi), presupunând că 

şi forma minuta - în fazele ei iniţiale – ar avea 

capacităţi de endocitoză şi digestie. În general, 

forma minuta e considerată drept forma primară 

de E. histolytica, capabilă să închisteze în lumenul 

intestinal. În accepţiunea noastră, ar trebui 

44


diferenţiat în mod edificator între minuta endocitară 

şi minuta prechistică. Minuta endocitară 

ar fi în consecinţă o formă de durată, în timp ce 

minuta prechistică ar fi doar o formă de trecere. 

Prechiştii identificaţi de noi în cultura Aa(Sm) 

sunt tipuri celulare cu o viaţă foarte scurtă, determinate 

prin diviziune la închistare rapidă şi 

imediată. 

Se presupune că, atunci când rezistenţa organismului 

gazdă este redusă, forma “minuta” 

ar converti în forma “magna”, care invadează 

peretele intestinului [32]. Condiţiile de mediu 

care ar putea duce la o asemenea conversie 

rămân neclare [33]. Conversia ar putea fi facilitată 

de coinfecţii bacteriene sau modificări în 

microbiota intestinului, în sensul apariţiei unor 

bacterii ce avantajează amibele. 

Tipizarea magna/minuta rămâne oarecum 

ambiguă, prea îngustă şi prea puţin relevantă. 

Urmând considerentele de mai sus, ar urma ca 

o subpopulaţie minuta să cuprindă atât forme 

primare, endocitare, cât şi forme finale, prechistice. 

Pentru perpetuarea speciei, subpopulaţia 

minuta ar fi suficientă. Subpopulatia magna ar 

fi o apariţie adaptativă, homogenă, mai mult sau 

mai putin accidentală; o forma tisulară nu absolut 

obligatorie, lipsită de capacitate de închistare 

şi, prin urmare, nu absolut necesară în scopul 

perpetuării speciei. 

Terminologia utilizată de noi în studiul de 

faţă se bazează pe cunostinţele recente din domeniul 

biologiei celulare şi are un caracter interdisciplinar 

şi integrativ. O limbă comună 

permite comparaţii şi deci o mai bună înţelegere 

a fenomenelor de diferenţiere celulară de la diferite 

nivele evolutive, cum sunt de exemplu 

protistele şi metazoarele. Experienţa noastră cu 

culturile Aa(Sm) pe termen lung arată convieţuirea 

in vitro a cel puţin două subpopulaţii distincte, 

generate de două linii autoreproductive 

diferite, cu durată de viaţă diferită, şi anume: (i) 

linia autoreproductivă TD6 LT , ce stă la baza subpopulaţiei 

producătore de chişti, analoagă formei 

minuta , care susţine în cultură închistarea 

ciclică, şi işi încetează proliferarea în condiţii de 

viaţă neprielnice, şi (ii) linia autoreproductivă 

QD24 LT , ce stă la baza subpopulaţiei neproducătoare 

de chişti, analoagă formei magna, linie 

specializată în producţia de celule-rezervă, 

inerte din punct de vedere mitotic. Departe de a 

fi o formă accidentală, subpopulaţia neproducătoare 

de chişti posedă un mecanism biologic de 

mare potenţial multiplicativ, reintroducând celulele-rezervă 

în ciclul celular şi întreaga subpopulaţie 

în diviziune. 

Numărul de celule autoreplicative creşte 

astfel de până la opt ori (factor de multiplicare: 

=8x), în decurs de numai 2-3 ore. Atât celulele 

autoreproductive (D1), cât şi celulele-rezervă 

surori (D2) generate de linia QD24 LT supravieţuiesc 

timp îndelungat in vitro, în nenumărate 

pasaje succesive. Linia QD24 LT este aşadar o 

linie continuă (permanentă) şi omniprezentă, în 

timp ce linia producătoare de chişti TD6 LT pare 

a fi o linie mai hipoxică şi discontinuă/temporară, 

cu o durată mai scurtă de viaţă. Rezultate 

preliminare privind dechistarea în culturile 

Aa(Sm), ne îndreptăţesc a pune ipoteza unei a 

treia linii celulare, şi anume o linie metachistică, 

primară, în ciclul de viaţă al E.invadens. Problema 

va fi discutată pe larg într-o lucrare viitoare, 

ca de altfel şi problema duratei ciclului 

celular, în funcţie de mediu. 

În contrast cu celulele de autoreînnoire D1 

ale liniei QD24 LT , cu ciclul celular de cca 24 h 

(AGT24), celulele-rezervă rezistă în cultură 

până la sfârşitul fazei staţionare (t128) mărinduşi 

volumul celular - prin ingerare masivă de bacterii 

– până la aproximativ 50-60 μ. Probabil că 

in vivo, celulele-rezervă ar putea supravieţui nelimitat 

în situaţia unei nutriţii permanente. Rămâne 

de clarificat în viitor, dacă celulele în stare 

de repaus G0 reprezintă o formă cu posibilităţi 

de invazie în ţesuturi, aşa cum ar fi de aşteptat. 

Închistarea ciclică (chiștii CE) 

Închistarea ciclică este expresia de diferenţiere 

a liniei celulare TD6 LT , ce produce în urma 

diviziunii asimetrice prechişti, drept celule D2 

diferenţiate ireversibil. TD6 LT este o linie de condiţie 

hipoxică, cu un ciclu celular scurt, de 

numai 6h (AGT6), ce proliferează în prima fază 

de creştere a culturii Aa(Sm) şi anume în primele 

30h. Atâta timp cât condiţiile hipoxice sunt 

favorabile proliferării ei, linia TD6 LT parcurge 

mai multe cicluri celulare, producând generaţii 

succesive de prechişti. Prechiştii sunt celule diferenţiate 

ireversibil, ce nu mai pot intra în ciclul 

celular. Fiind determinaţi pentru inchistare, pre- 

45


chiştii continuă diferenţierea către celula tetranucleată 

din interiorul chistului, considerată din 

punct de vedere al biologiei celulare drept un 

progenitor totipotent în stare de repaus, în vederea 

reluării ciclului de viaţă. Conversia prechist 

→ progenitor totipotent este rapidă şi complexă, 

cuprinzând atât elemente evolutive cât şi regresive. 

Prin ex-chistare, progenitorul totipotent dă 

naştere la opt amibule, care refac o nouă populaţie 

amibiană. 

Descoperirea închistării ciclice, cu chiști 

CE, fenomen observat pentru prima dată în culturile 

Aa(Sm), ne duce mai aproape de înţelegerea 

fenomenului de închistare „spontană”, ob - 

servat de diverşi autori în culturile de E. invadens. 

Diverse modele lipsite de validare experimentală 

au dus din păcate la concluzii ambigue. 

Unii autori relatează cazuri de închistare spontană 

în faza târzie de creştere, scurt timp înainte 

de perioada staţionară şi de faza de liză [34]. Alţi 

autori au observat o închistare spontana în populaţiile 

de E. invadens crescute în mediu LG, 

privat de glucoză [35]. Nu este exclus ca închistarea 

„spontană” sa fie un caz nelămurit de închistare 

ciclică, susţinut de către o linie autoreproductivă, 

extrem de redusă la număr, înrudită 

cu linia QD24 LT , descoperită de noi. 

Închistarea extra-ciclică prin conversie 

indusă (chiști DI) 

Majoritatea autorilor au studiat procesul de 

închistare extra-ciclică, în care celule vegetative 

sunt induse la formare de chişti DI prin conversie 

directă, sub acţiunea unor stimuli fizico-chimici. 

Cu toate acestea, mecanismele moleculare 

ce susţin închistarea extra-ciclică au rămas neînţelese 

şi problema confuză [35-39]. În ciuda 

multiplelor studii întreprinse, nu s-a putut clarifica 

interrelaţia dintre sinteza de ADN, diviziunea 

celulară şi formarea chiştilor [40-43]. Nu se 

ştie încă precis dacă conversia directă necesită 

o sinteză prealabilă de ADN şi care dintre celule 

necesită sinteza. Conceptul unui proces multifazic, 

cu o fază sintetică proprie [44-45], rămâne 

în discuţie, dar s-ar putea să nu fie valabil pentru 

oricare fel de celulă vegetativă. 

Printre agenţii chimici ce ar induce conversia 

în habitatul natural sunt luaţi în discuţie acizii 

graşi cu catenă scurtă (SCFA) produşi de 

flora colonului şi de stratul mucos al intestinului 

[35], componentele mediilor xenice complexe 

[46] şi factorii de stres [47-49]. Singh şi Ehrenkaufer 

[46] arată că în culturile pe termen lung 

E. invadens oscilează permanent între forme vegetative 

şi forme chistice. Pentru tulpinile axenice 

de E. histolytica nu există în prezent tehnici 

reproductibile de închistare. Experimentele cu 

apă oxigenată (peroxid de hidrogen H2O2) au 

indus conversia unor trofozoiţi din cultură (cca 

10%) în aşa numiti CLS, formaţiuni pseudochistice 

multinucleate (1-4 nuclei), cu perete de 

chitină şi rezistenţă faţă de detergenţi [50-51], 

interpretate drept structuri intermediare pe drumul 

conversiei induse de stresul oxidativ. 

În perspectivă, ne propunem să adâncim 

studiul şi analiza fenomenelor de conversie intercelulară 

in cadrul ciclului de viaţă la E. invadens 

şi să urmărim semnalele hipoxice din 

sedimentul bacterian în regresie. Atenţia noastră 

se îndreaptă îndeosebi asupra celulelor din subpopulaţia 

vegetativă, neproducătoare de chişti. 

Vom urmări „soarta evolutivă” şi capacitatea de 

conversie a celulelor-rezervă şi a celulelor autoreproductive 

QD24 LT atât în mediul Aa(Sm), cât 

şi în afara acestuia. Un interes special îl prezintă 

linia primară metachistică cu posibilităţile ei de 

evoluţie. Cercetări premergătoare au arătat că 

capacitatea de conversie a celulelor autoreproductive 

QD24 LT depinde de poziţia acestora în 

ciclul celular. Mecanismele moleculare de conversie 

la chist sunt blocate atunci cand celula părăseşte 

faza G1 şi revin abia după sfârşitul 

diviziunii. În cursul procesului de închistare directă 

(ne-ciclică) celulele fiice tinere, ce au ieșit 

din diviziune, pot închista, fără să treacă printr-o 

fază adiţională de sinteză de ADN, fapt care 

arată, că sinteza adiţională de ADN nu este o 

conditio sine qua non pentru conversia la chist 

şi nicidecum o fază obligatorie sau chiar parte 

efectivă din procesul de închistare. Situaţia se 

schimbă la celulele-rezervă (D2), ieşite din ciclul 

celular şi parcate în stare G0, în rezervorul 

subpopulaţiei vegetative. Părţi din genomul celulelor 

mitotic-inactivate par a fi blocate sau 

pierdute. Pentru refacerea lor, sunt intr-adevăr 

necesare cicluri adiţionale de sinteză de ADN, 

fără de care celula vegetativă mononucleată nu 

poate trece la starea tetranucleată a celulei interchistice. 

46


MULÞUMIRI 

Dr. Helmut Zaharia, specialist în genetică 

celulară, Kiel, Germania, Dr. Frank Wohlrab, 

specialist în patologia celulară, Leipzig, Germania, 

Dr. Eugenia Rodica Niculescu, microbiolog, 

Augsburg, Germania, pentru sprijin în revizuirea 

lucrării, Dr. Dennis Thomas, München, Germania 

şi Robert Braun, Connecticut, USA. 

AUTORUL 

Este fost cercetător al Institutului Dr. I. Cantacuzino 

în perioada 1965-1969. A lucrat în secţia 

de Parazitologie condusă de Prof. Dr. Gh. 

Lupaşcu pe probleme de biologie celulară a protozoarelor 

parazite. 

BIBLIOGRAFIE 

1. Diamond LS. Techniques of axenic cultivation of Entamoeba 

histolytica Schaudinn, 1903 and E. histoly tica 

- like amoebae. J. Parasitol. 1968. 54: 1047-1056. 

2. Diamond LS. Entamoeba, Giardia and Trichomonas. 

In: In vitro methods for parasitic cultivation, (Ed. A. 

E. Taylor, J. R. Baker). 1987. Academic Press, London, 

pp 1-17. 

3. Diamond LS, Harlow DR, Cunnick CC. A new medium 

fort the axenic cultivation of Entamoeba histolytica 

and other Entamoeba. Trans. Roy. Soc. Trop. Med. 

Hyg. 1978. 72: 4331- 4332. 

4. Bracha R, Mirelman D. Virulence of Entamoeba histolytica 

trophozoites. Effects of bacteria, microaerobic 

conditions, and metronidazol. J. Exp.Med. 1984. 160: 

353-368. 

5. Chang SL. Cultural, cytological and ecological observations 

on the amoeba stage of Naegleria gruberi. J. 

Gen. Microbiol. 1958. 18: 565-578. 

6. Mirelman D. Ameba-bacterium relationship in amebiasis. 

Microbiol. Rev. 1987. 51: 272-284 (doi: 0146- 

0749/87/020272-13$02.00/0). 

7. Chang SL. Studies on Endamoeba histolytica. V. The 

relation of oxidation reduction potentials to the growth, 

encystation and excystation of E. histolytica in water. 

Parasitol. 1946. 37: 100-112. 

8. Jacobs L. Oxidation-reduction potentials in relation to 

the cultivation of Endamoeba histolytica. J. Parasitol. 

1941. 27 (Suppl.): 31. 

9. Nakamura M. Nutrition and physiology of Endamoeba 

histolytica. Bacteriol. Rev. 1953. 17: 189-212 

(PMID: 13081544) (PMCID: PMC180769). 

10. Reinertson JW, Thomson PE. Experimental amoebic 

hepatitis in hamsters. Proc. Soc. Exp Biol. Med. 

1951. 76: 518-521 (PMID: 14844258). 

11. Troller JA. and Frazier WC. Repression of Staphylococcus 

aureus by food bacteria. II. Causes of inhibition. 

Appl Microbiol. 1962. 11: 163-165. 

12. Clifton CE. A comparison of the metabolic activities 

of Aerobacter aerogenes , Eberthella typhi and Escherichia 

coli. J. Bacteriol. 1937. 33: 145-162. 

13. Niculescu VF. A culture medium for study of the cell 

system in E. invadens. 3rd Intern. Congr. Parasit. Munich, 

ICOPA III, G3; 1974a. Published on-line. 

http://entamoebainvadens2010vfn.wordpress.com. 

14. Niculescu VF. The primitive cell system of E. invadens 

as related to cell differentiation. 3 rd Intern. Congr. 

Parasit. Munich, ICOPA III, A11; 1974b. Published 

on-line http://entamoebainvadens2010vfn. wordpress.com. 

15. Jacob E. Das Redoxpotential in Bakterienkulturen. 

II. Ztschr. f. Allg.Mikrobiol. 1971. 

11: 691-734 (doi: 10.1002/jobm.19710110809). 

16. Kerk NM., Feldman LJ. A biochemical model for 

initiation and maintenance of the quiescent center-implications 

for organization of root meristems. Development 

1999. 121: 2825-2833 

17. Reichelt JP. Specific checkpoints regulate plant cell 

cycle progression in response to oxidative stress. 

Plant. J. 1999. 17: 647-656. 

18. Russo T, Zambrano N, Esposito F, Ammendola R, 

Cimino F, Fiscella M, Jackman J, O’Connor PM, 

Anderson CW, Appella E. A p53 independent pathway 

for activation of WAF1/CIP1 expression following 

oxidative stress. J. Biol. Chem. 1995. 270: 

29386-29391 (doi: 10.1074/jbc.270.49.29386). 

19. Katto N, Esaka M. Changes in ascorbate oxidase 

gene expression and ascorbate levels in cell division 

and cell elongation in tobacco cells. Physiol. Plant 

1999. 105: 321-329. 

20. Vernoux T. The root meristemless1/cadmium sensitive2 

gene defines a glutathione –dependent pathway 

involved in initiation and maintenance of cell division 

during postembryonic root development. Plant Cell 

2000. 12: 97-110. 

21. Schafer FQ, Buettner GR. Redox environment of 

the cell as viewed through the redox state of the glutathione 

disulfide/glutathione couple. Free Radic. 

Biol. Med. 2001. 30: 1191-1212 (PII S0891- 

5849(01)00480-4) (PMID: 11368918). 

22. Potters G, Horemans N., Caubergs RJ., Asard H. 

Ascorbate and dehydroascorbate influence cell cycle 

progression in a tobacco suspension. Plant Physiol. 

2000. 124: 17-20 (doi: 10.1104/pp.124.1.17). 

23. Dixit R, Cyr R. Cell damage and reactive oxygen species 

production induced by fluorescence microscopy: 

effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence 

microscopy. The Plant J. 2003. 36: 280-290 

(doi: 10.1046/j.1365-313X.2003.01868.x). 

24. Nakamura H, Nakamura K, Yodoi J. Redox regulation 

of cellular activation. Ann. Rev. Immunol. 1997. 

15: 351-369. 

25. Moon H, Lee B, Choi G, Shin D, Prasad DT, Lee 

O, Kwak SS, Kim DH, Nam J, Bahk J, Hong JC, 

Lee SY, Cho MJ, Lim CO, Yun DJ. NDP Kinase 2 

47


interacts with two oxidative stress-activated MAPKs 

to regulate cellular redox state and enhance multiple 

stress tolerance in transgenic plants. PNAS. 2003. 

100:358-363 (doi: 10.1073/pnas.252641899) 

(PMCID: PMC140977). 

26. Calder A, Roth-Albin I, Bhatia S, Pilquil C, Lee 

JH, Bhatia M, Levadoux-Martin M, McNicol J, 

Russell J, Collins T, Draper JS. Lengthened G1 

Phase Indicates Differentiation Status in Human Embryonic 

Stem Cells. Stem Cells Dev. 2012. ahead of 

print (doi:10.1089/scd.2012.0168) . 

27. Cometa I, Schatz S, Trzyna W, Rogerson A. Tolerance 

of naked amoebae to low oxygen levels with an 

emphasis to the genus Acanthamoeba. Acta Protozool. 

2011. 50: 33-40. 

28. Turner NA, Biagini GA, Lloyd D. Anaerobiosis induced 

differentiation of Acanthamoeba castelanii. 

FEMS Microbiol. Letters. 1997. 157: 149-153 (doi: 

10.1111/j.1574-6968.1997.tb12766.x). 

29. Kuhl M, Rickelt RF, Thar R. Combined imaging of 

bacteria and oxygen in biofilms. Appl.Environ.Microbiol. 

2007. 73: 6289-6295 (doi: 10.1128/AEM.01574- 

07). 

30. Barbeau J, Buhler T. Biofilms augment the number 

of free-living amoebae in dental unit waterlines. Res. 

Microbiol. 2001. 152: 753-760. 

31. Goldman M, Davis V. Isolation of different-size substrains 

from three stock cultures of Entamoeba histolytica, 

with observations on spontaneous size changes 

affecting whole populations. J Protozool. 1965. 12: 

509-523 (doi: 10.1111/j.1550-7408.1965.tb03250.x). 

32. Kotpal RT. Entamoeba histolytica. In: Modern textbook 

of Zoology: Invertebrates. 2010. 2.nd.ed, 

chap.7, pp 72-78 (Ed. Rakesh Kumar Rastogi). Capital 

Offset Press New Delhi. 

33. Stein E. Anorectal and colon diseases. Amoebiasis, 

pp 496-499 In: Textobook and color atlas of Procto - 

logy. 2003. 4th ed. Springer Verlag Berlin, Heidelberg. 

34. Vazquezdelara-Cisneros LG, Arroyo-Begovich M. 

Induction of encystation of Entamoeba invadens by 

removal of glucose from the culture medium. J. Parasitol. 

1984. 70: 629-633 (http://www.jstor.org/stable/3281741). 

35. Byers J, Faigle W, Eichinger D. Colonic short-chain 

fatty acids inhibit encystation of Entamoeba invadens. 

Cell.Microbiol. 2005. 7: 269-279 (doi: 

10.1111/j.1462-5822.2004.00457.x). 

36. Kumagai M, Makioka A, Ohtomo H, Kobayashi S, 

Takeuchi T. Inhibition of encystation of Entamoeba 

invadens by aphidicolin. Tokai J. Exp. Clin. Med. 

1998. 23: 313-317. 

37. Satish S, Bakre AA, Bhattacharya S, Bhattacharya 

A. Stress-dependent expression of a polymorphic, 

charged antigen in the protozoan parasite Entamoeba 

histolytica. Infect. Immun. 2003. 71: 4472–4486. 

38. Ebert F, Bachmann A, Nakada-Tsukui K, Hennings 

I, Drescher B, Nozaki T, Tannich E, Bruchhaus I. 

An Entamoeba cysteine peptidase specifically expressed 

during encystation. Parasitol. Int. 2008. 57: 521- 

524 (doi: 10.1016/j.parint.2008.07.002). 

39. Marien D. Mechanisms of encystation of Entamoeba 

invadens. Published online. 2010 (doi:10.1371/journal.pntd.0000607). 

40. Balamuth WJ. Effects of some environmental factors 

upon growth and encystations of Entamoeba invadens. 

J. Parasitol. 1962. 48: 101-109. 

41. Meyer DF, Morgan RJ. Evidence for a link between 

division and differentiation in Entamoeba invadens. 

J.Protozool. 1971. 18: 282-284 (PMID: 5091278). 

42. Thepsuparungsikul V, Seng L, Bailey, GB. Differentiation 

of Entamoeba: Encystation of Entamoeba 

invadens in monoxenic and axenic cultures. J. Parasitol. 

1971. 57: 1288-1292. 

43. Sirijintakarn P, Bailey GB. The relationship of DNA 

synthesis and cell cycle events to encystation by Entamoeba 

invadens. Arch. Invest. Med. (Mexico) 1980. 

11: 3-10 (Suppl.1) (PMID: 7469646). 

44. Eichinger D. Encystation in parasitic protozoa. Curr. 

Opin. Microbiol. 2001. 4: 421-426. 

45. Singh N, Bhattacharya S, Paul J. Entamoeba invadens: 

Dynamics of DNA synthesis during differentiation 

from trophozoite to cyst. Exp. Parasitol. 2010. 

127:329-333 (doi:10.1016/j.exppara.2010.08.013). 

46. Singh U, Ehrenkaufer GM. Recent insights into Entamoeba 

development: identification of transcriptional 

networks associated with stage conversion. Int. J. 

Para sitol. 2009. 39 : 41-47 (doi:10.1016/j.ijpara. 

2008.09.004.) (PMCID: PMC2648836). 

47. Balamuth WJ. Biological studies on Entamoeba histolytica. 

III. Induced encystation in several mediums, 

including an account of a new procedure. J. Infect. 

Dis. 1951. 88: 230-236 (PMID:14850747). 

48. Robinson GL. The laboratory diagnosis of human parasitic 

amoebae. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 1968. 

62: 285-294. 

49. Chayen A, Avron B, Nuchamiwitz Y, Mirelman D. 

Appearance of sialoglyco-proteins in encysting cells 

of Entamoeba histolytica. Infect. Immun. 1988. 56: 

673-681 

50. Aguilar-Diaz H, Diaz-Gallardo M, Laclette JP, 

Carrero JC. In vitro induction of Entamoeba histoly - 

tica cyst-like structures from trophozoites. Plos Negl 

Trop Dis. 2010. 4(2): e607 (doi:10.1371/journal. 

pntd.0000607). 

51. Aguilar-Diaz H, Laclette JP, Carrero JC. Silencing 

of Entamoeba histolytica glucosamine 6 phosphate 

isomerase by RNA interference inhibits the formation 

of cyst-like structures. BioMed Research International. 

2013. (doi:10.1155/2013/758341). 

48

TWO CAse RePORTs ON VIsCeRAL LeIsHMANIAsIs 

DIAGNOseD IN ROMANIA 

Marian Ghervan Gogoaşe 1 , Irina Teodorescu 2 *, 

Carmen Preda 1 , Simona Claudia Ionescu 3 

1 Fundeni Clinical institute, 2 University of bucharest, Faculty of biology, Romania 

3 victor babeş infectious and tropical diseases Clinical Hospital, bucharest, Romania 

ABsTRACT 

Two cases of visceral leishmaniasis with a species from Leishmania donovani complex were detected 

in the Fundeni Clinical Institute. In one case, two infection sources were possible: one from Italy, 

where the patient worked three years, the other from the Southwest of Romania (Dolj County), where 

he was resident and where few human and canine leishmaniasis cases were re gistered in the past. In 

the second case, the patient lived in the Northeast of Romania (Iaşi County), but worked in the same 

southwest zone. In both cases, a local transmission should be considered, situation that could amplify 

and extend in the future, supposing that increased temperatures will persist, favoring the persistence 

and multiplication of autochthonous and allochthonous Phlebotomus vector species. 

Keywords: visceral leishmaniasis, Leishmania, Romania 

INTRODUCTION 

Human leishmaniasis is a major vector-borne 

disease, endemic in 88 countries (16 “developed” 

and 72 “developing” countries) [1], caused by more 

than 20 species and strains, morphologically indistinguishable, 

of the intracellular flagellate protozoan 

of genus Leishmania, subgenus Leishmania (Kinetoplastida, 

Trypanosomatidae). World Health Organization 

classified it as one of the top ten threatening 

infective conditions [2]). An estimated 350 million 

people are at risk of infection with a global yearly 

incidence of 1-1.5 million for cutaneous and 500,000 

for visceral leishmaniasis, including about 50 thousand 

deaths [3]. The clinical manifestations of the 

disease fall into three major forms: visceral, mucocutaneous 

and cutaneous (Seventh Programme Report 

of Tropical Diseases Research), sometimes with 

disseminated disease. 

The etiologic agent of visceral leishmaniasis is 

Leishmania Leishmania donovani complex, which 

according to the previous studies comprises four 

species: L.(L.) donovani sensu stricto, L.(L.) infantum, 

L.(L.) chagasi and L.(L.) archibaldi. In recent 

studies three species are considered: L.(L.) donovani 

sensu stricto in East Africa, L. (L.) infantum in Europe, 

Africa, China, Latin America (in the latter region 

named L. chagasi) and L.(L.) archibaldi in East 

Africa [4]. Other authors considered two species: L. 

(L.) infantum, in Europe, North Africa, South and 

Central America, and L.(L.) donovani sensu stricto, 

in East-Africa, India, and parts of the Middle East 

[5]. In the genus Leishmania, subgenus Leishmania, 

establish five species: L. (L.) donovani, L. (L.) 

major, L. (L.) tropica, and L. (L.) mexicana [6]. In 

L. (L.) donovani species can be recognized L. (L.) 

donovani infantum. 

Visceral leishmaniasis is an opportunistic infection 

associated with various immunodeficiency conditions: 

HIV infection, neoplasma, organ transplan - 

tation, and long-term treatment with immunosuppressive 

agents. Visceral leishmaniasis (VL) is a 

common complication in AIDS patients living in 

Leishmania-endemic areas [7]. The co-infection 

Leishmania and human immunodeficiency virus 

(HIV) [8, 9], both infecting human macrophages, 

leads to a drastic increase in the severity of leishmaniasis 

cases. The first case of leishmaniasis associated 

with HIV was reported in 1985 and later, several 

cases of co-infection have been reported from over 

*Corresponding author: Irina Teodorescu, University of Bucharest, Romania, Faculty of Biology, e-mail: teodorescubiologie@yahoo.com 

49

GHERVAN GOGOAŞE et al. 

35 countries around the world, the majority in South- 

Western Europe [10, 11, 12]. This co-infection became 

endemic in many parts of Southern Europe, 

more than 25-75 % of adult cases of visceral leishmaniasis 

being detected in HIV-infected persons 

[13]. In immunocompromised persons (AIDS), the 

leishmaniasis infections, initially asymptomatic, 

could progress to severe clinical forms, the co-infections 

accelerating and aggravating both AIDS and 

leishmaniasis symptoms. According to the World 

Health Organization (2012) “The two diseases are 

mutually reinforcing: HIV- infected people are particularly 

vulnerable to VL, while VL accelerates 

HIV replication and progression to AIDS”. This coinfection 

could have major consequences for blood 

banks. It was shown that asymptomatic blood 

donors living in Southern France had 3.4 % leishmaniasis 

seropositivity, in Greece 15 % and in Spain 

22.1 % [14, 15, 16]. 

The vectors for Leishmania species are Diptera 

Psychodidae (sand flies) species belonging to Phlebotomus 

genus in Europe, Africa and Asia and to 

Lutzomyia genus in America [17, 18]. 

In Southern Europe are present visceral leishmaniasis 

(with most numerous cases, being the most 

dangerous and lethal if untreated), and cutaneous 

leishmaniasis (the most benign) [19]. The human 

leishmaniasis incidence is relatively low (8.53 cases 

to 100,000 people, most cases being registered in 

Turkey). The visceral leishmaniasis is found in Albania, 

Bosnia, Croatia, Cyprus, France (Southern regions), 

Greece, Hungary, Macedonia, Malta, 

Portugal, Romania, Spain, Serbia and Montenegro, 

and Turkey. Visceral leishmaniasis has spread northward 

lately, as shown in the recent reports of indigenous 

cases in Northern Italy and Southern Germany. 

Each year approximately 3,950 autochthonous 

human cases (700 excluding Turkey) were reported, 

but from each symptomatic case, a number of 30- 

100 asymptomatic ones were estimated [20]. In the 

recent years, an increasing proportion of adult cases 

(especially in HIV, but also in non-HIV infected individuals) 

with visceral leishmaniasis have been re - 

gistered, while in the past this disease was 

cha racteristic for children [21]. First autochthonous 

cases considered as L. donovani infections in Europe 

were detected in Cyprus [22, 23]. 

L. (L.) infantum also infects and represents one 

of the main killers of dogs (with a seroprevalence up 

to 25 % in Southern Europe, up to 34 % in Spain 

[24], in the highly endemic areas, and approximately 

5,000 clinical cases each year in France). The dogs, 

symptomatic or asymptomatic [25], constitute an important 

reservoir of the parasite, which Phlebotomus 

vectors could infect and transmit the infection to humans 

[26-30]. Another danger is represented by the 

possibility that L. (L). infantum might be exported 

through dogs, outside Europe. 

The cutaneous leishmaniasis with L.(L.) major, 

L. (L.) tropica and even L. (L.) infantum etiologic 

agents has been reported in Albania, Austria, Bosnia 

and Herzegovina, Bulgaria, Croatia, Cyprus, France, 

Greece, Italy, Malta, Monaco, Portugal, Romania, 

Spain (including the Canary Islands), Serbia and 

Montenegro. 

In Romania, [31, 32] some authors were mentioned 

(Copăceanu et al., 1955; Bârzu et al., 1956; 

Lupaşcu et al., 1963; Zaharia, 1972; Wahirapp et al., 

1976; Diaconu, 1981) who diagnosed visceral and 

cutaneous leishmaniasis. Other Romanian references 

to leishmaniosis in Romania were made between 

1919 and 1958 [33, 34, 35]. Some cases of imported 

visceral and cutaneous leihmaniasis (in travelers or 

workers in endemic areas) were also recently detected 

[36-50]. 

MATERIALS AND METHODS 

Investigations were carried out on two patients 

hospitalized in 2007 at Fundeni Clinical Institute. 

The cytological and histological exams of liver 

biopsy were performed using Van Gieson stain. The 

patient charts containing the results of clinical investigations 

such as physical, biochemical, hematological 

exams, abdominal ultrasounds, Chest X-Rays, 

and bacteriological assays were used. Patient interviews 

offered epidemiological information. 

RESULTS 

First case report 

23 y.o. male patient from Radovan, Dolj 

County, who worked in Italy three years ago, was 

hospita lized at Fundeni Clinical Institute for one 

month with history of pain in the left upper abdominal 

quadrant, described as a stinging sensation; a 

pain arising on effort at the level of the right upper 

abdominal quadrant and marked weight loss (16 kg). 

Leptospirosis and septicemia from an acute orchiepididymitis 

were taken into consideration as preliminary 

diagnosis. 

Laboratory results and specific investigations 

Blood cells count showed pancytopenia 

(Leukocytes 2,600, Hemoglobin 8.0 g/dl, Thrombocytes 

81,000) with a moderate anisocytosis (micro- 

50

Two case reports on visceral leishmaniasis diagnosed in Romania 

cytes), moderate hypochromia, and bulls eye erythrocytes 

with a tendency towards rouleaux formation. 

ESR was 50 mm/hr. Fibrinogen was normal. 

Liver enzymes were high: GGT = 201 µ/1, ALT = 

154 µ /1. 

Blood cultures were positive for coagulasenegative 

staphylococci. RPR was negative. White 

cell formula showed: neutrophils 47 %, lymphocytes 

45 %, monocytes 2 %, myelocytes 6 %. Negative results 

for HBV and HCV were registered. IgG anti- 

CMV were 151.3/15 (positive) and IgM anti-CMV 

were 0.190/0.500 (negative). 

Ultrasound study of the abdomen revealed 

grade I steatosis of the liver with hyperechoic structure, 

with granular character. Spleno-portal axis, 

gallbladder and the pancreas were within normal 

limits. The spleen appeared to have irregular margins, 

with slightly enlarged veins in the hilus. There 

was no ascitis fluid in the peritoneum. The retroperitoneal 

space was normal. Chest X-Ray was normal. 

Bone marrow biopsy from the iliac bone with 

slide preparations showed rich cellularity with a 

granulocytic line within normal range, with good 

maturation. There were frequent mature lymphocytes, 

approximately 17 %, and frequent reactive 

plasmocytes (6 %). The red cell line was normoblastic. 

Megakaryocytes were present, displaying a 

quantitatively slightly reduced thrombocytoformation. 

The bone marrow biopsy showed therefore hypercellular 

marrow with slight plasmocytosis. 

By liver biopsy a relatively small fragment 

(~8mm length) of liver tissue was obtained, with 

normal lobular architecture, slightly to moderately 

enlarged portal spaces, with lympho-plasmocytic inflammatory 

infiltrate, and rare granuloma with epithelioid 

and multinucleated giant cells. No portal 

fibrosis was noted. Rare hemophagocytosis images 

were observed. The following aspects were observed 

intralobularly: chronic intrasinusoidal inflammatory 

infiltrate, hypertrophy and Kupffer cell hyperplasia, 

and granuloma sketches made up of macrophages 

and epithelioid cells. Very small basophilic 

macrophagocytic inclusions (1-2 microns in diameter) 

were noticeable, some of them with a clear 

halo surrounding them, indicating the presence 

of Leishmania spp. amastigotes (Figs. 1, 2 and 3). 

Second case report 

35 y.o. male residing in Romaneşti, Iaşi County, 

was hospitalized in the Gastroenterology Clinic of 

Fundeni Clinical Institute following a transfer from 

an infectious disease clinic in Iaşi, where the patient 

was hospitalized for one month, with a prolonged 

febrile syndrome (40-41 Celsius degrees), with no 

response to i.v. antibiotherapy. The preliminary diag - 

nosis was splenomegaly with hypersplenism. A suspicion 

of hydatid splenic cyst was raised. The patient 

was admitted to the ICU after ten days of investigations 

and i.v. antibiotherapy due to the onset of hypoxemic 

respiratory insufficiency. At the entry in 

ICU, the patient was febrile (39.6 Celsius degrees), 

Fig. 1 - Liver tissue biopsy: histiocytes including Leishmania amastigotes 

(immersion oil x 100, Giemsa staining) 

51



(immersion oil x 100, Giemsa staining) 

polypneic and tachycardic, with jaundice and ecchymosed 

at the site of venous punction. 

Laboratory results and specific investigations 

Blood count showed severe pancytopenia with 

1,200 leukocytes, anemia with Hemoglobin of 6.3 

g/dl, and very high levels of liver enzymes. ESR was 

1 lOmm/hr, and there was thrombocytopenia of 

14,000. Microscopic exam of liver tissue revealed 

the presence of basophilic inclusions, which highlighted 

Leishmania spp. infection. Serology for 

Leishmania (performed at the Clinical Hospital for 

Infectious and Tropical Diseases “Dr. Victor Babeş”) 

was positive and leishmaniasis infection was confirmed. 

Acute renal insufficiency developed after 


(immersion oil x 100, Giemsa staining) (digitally processing) 

52


four days of treatment, with signs of acute tubular 

necrosis. Kidney functions returned to normal by hemofiltration 

and hemodialysis. Liver functions also 

returned to normal. During the hospitalization, while 

the patient’s status was improving, a splenectomy 

was done for the large splenic hydatid cyst (inactivation, 

evacuation, pericystectomy). The polyneuropathy 

with tetraplegia persisted and the 

neuro logical status worsened. The patient developed 

severe sepsis from the lung infection due to prolonged 

ventilator support, with acute renal failure, 

which led to death. 

DISCUSSION 

The typical clinical and laboratory features 

of visceral leishmaniasis include high fever, hepatosplenomegaly, 

pancytopenia and hypergammaglobulinaemia, 

involving virtually any organ. 

For the first patient, who worked in Italy, we 

could suppose two possibilities of infection: from 

Italy, an endemic zone for leishmaniasis, or from an 

autochthonous source, i.e. in Oltenia, where the patient 

lived. Few cases of human leishmaniasis were 

registered near Craiova, in Southwest Dolj, in 1912, 

1945, 1953-1954 and some canine leishmaniasis 

cases were signaled in Caraş-Severin County, in 

1929 and 1957. In these zones some Phlebotomus 

vectors for Leishmania were also present [51]. 

For the second patient inhabiting in Northeast 

area of the country (Iaşi County), no local source of 

infection is documented, but he worked in the Southwest 

area of Romania, where cases of human leishmaniasis 

were registered and we could thus suppose 

the possibility of existence of autochthonous source 

of infection. 

CONCLUSIONS 

In Fundeni Clinical Institute two cases of visceral 

leishmaniasis were investigated: although in 

one case an imported leishmaniasis case was possible, 

in both cases a local transmission from an infection 

source located in the Southwest zone of 

Romania can be considered. 

In the patient who worked in Italy, a suggestive 

clinicalpresentation associated with his geographical 

travel history could lead to an early consideration of 

visceral leishmaniasis. Laboratory results and other 

specific investigations (febrile syndrome, pancytopenia, 

1-2 microns basophilic inclusions in liver 

tissue indicating the presence of Leishmania spp. 

amastigotes) confirmed the diagnosis. 

In the patient resident in Northeast area of country 

(Iaşi County) the microscopic exam of liver tissue 

indicated the presence of Leishmania spp. 

amastigotes and serology was positive to Leishmania 

infection. Leishmaniasis with severe pancytopenia 

and anemia, accompanied by other clinical 

signs (hypoxemic respiratory insufficiency, a large 

splenic hydatid cyst and consecutive splenectomy, 

acute renal insufficiency with tubular necrosis, lung 

infection and severe sepsis) could have a severe 

prognosis and lead to death. 

The two diagnosed cases represent an alarm signal, 

in the context of global climate changes, with a 

continuing warming tendency, favoring the multiplication 

of autochthonous Phlebotomus species, but 

also the possibility of penetration in Romania of 

other Phlebotomus species, which are vectors for 

Leishmania, raising the risk for Romania to become 

an endemic area for leishmaniasis. 

REFERENCES 

1. Desjeux P, Alvar J. Leishmania/HIV co-infections: 

epidemiology in Europe, Ann Trop Med Parasit. 2003. 

97 (1): 3-15. 

2. World Health Organization. WHO Techical Report Series: 

control of the leishmaniasis. Report of a meeting 

of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniases. 

World Health Organization: Geneva; 22-26 

March 2010. 

3. Ezra N, Ochoa Maria Teresa, Craft N. Human Immu - 

nodeficiency Virus and Leishmaniasis, J Glob Infect Dis. 

2010. 2 (3): 248–257. doi: 10.4103/0974-777X.68528. 

4. Quispe-Tintaya, KW, Laurent T, Decuypere Saskia, 

Hide Mallorie, Banuls Anne-Laure, De Doncker Simonne, 

Rijal S, Canavate Carmen, Campino L, Dujardin1 

J-C. Fluorogenic Assay for Molecular Typing 

of the Leishmania donovani Complex: Taxonomic and 

Cli nical Applications, The Jour Inf Dis. 2005. 192: 685– 

692. 

5. Lukeš J, Mauricio L Isabel, Schönian Gabriele, Dujardin 

J-Cl, Soteriadou Ketty, Dedet J P, Kuhls Katrin, 

Quispe Tintaya K W, Jirků M, Chocholová 

Eva, Haralambous C, Pratlong Francine, Oborník 

M, Horák A, Ayala F J, Miles M A. Evolutionary and 

geographical history of the Leishmania donovani complex 

with a revision of current taxonomy, Proc Nat 

Acad Sci USA. 2007. 104 (22): 9375-9380. 

6. Fraga J, Montalvo A M, De Doncker S, Dujardin J 

C, Van der Auwera G. Phylogeny of Leishmania 

species based on the heat-shock protein 70 gene, Infect 

Genet Evol. 2010. 10 (2): 238-245. doi: 10.1016/ 

j.meegid.2009.11.007. Epub 2009 Nov 11. 

7. Cota F Glaucia, de Sousa M R, Rabello Ana. Predictors 

of Visceral Leishmaniasis Relapse in HIV-Infected 

Patients: A Systematic Review. PLOS Neg Trop Dis. 

2011. 5, 6: e1153. doi:10.1371/journal.pntd.0001153. 

8. Agostoni C, Dorigoni N, Malfitano A, Caggese L, 

Marchetti G, Corona S, Gatti S, Scaglia M. Mediter- 

53


ranean leishmaniasis in HIV–infected patient: epidemiological, 

clinical, and diagnostic features of 22 cases. 

Infection, 1998. 26, 2, 93-9. 

9. Leishmaniasis and HIV coinfection WHO 2012 

http://www.who.int/leishmaniasis/burden/hiv_coinfection/burden_ 

hiv_coinfection/en/index.html. 

10. Alvar J, Canavate C, Gutierrez-Solar B, Jimenez 

M, Laguna F, Lopez-Velez R, Molona R, Moreno 

J. Leishmania and human immunodeficiency virus 

coinfection: the first years, Clin Microbiol Rev. 1997. 

10, 2, 298-319. 

11. Desjeux P, Alvar J, Leishmania/HIV co-infections: 


97, Suppl. 1, 3–15. 

12. Gradoni L, Gaeta G B, Pellizzer G, Maisto A, 

Scalone A. Mediterranean visceral leishmaniasis in 

pregnancy, Scand Journ Inf Dis. 1994. 26 (5): 627-629. 

13. Maguire J H, Leishmania, a Parasite on the Move, in 

Scheld W M, Craig W A, Hughes J M. Emerg Inf. 

1999. 99-111, ASM Press, Washington D.C. 

14. Le Fichoux Y, Quaranta J G, Aufeuvre J P, 

Lelievre A, Marty P, Suffia I. Occurrence of Leishmania 

infantum parasitemia in asymptomatic blood 

donors living in an area of endemicity in southern 

France, J Clin Microbiol. 1999. 37: 1953–1957. 

15. Riera Cristina, Fisa R, Udina M, Gállego M, Portus 

M. Detection of Leishmania infantum cryptic infection 

in asymptomatic blood donors living in an 

endemic area (Balearic Islands, Spain) by different diagnostic 

methods. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2004. 

98: 102-110. http://dx.doi.org/101016/S0035- 

9203(03)0015-4. 

16. Riera Cristina, Fisa R, López-Chejade P, Serra 

Teresa, Girona E, Jiménez MaTeresa, Muncunill J, 

Sedeño Matilde, Mascaró M, Udina Maria, Gállego 

M, Carrió J, Forteza A, Portús M. Asymptomatic 

infection by Leishmania infantum in blood donors 

from the Balearic Islands (Spain), Transfusion, 2008. 

48 (7): 1383-1389. DOI: 10.1111/j.1537- 

2995.2008.01708.x. 

17. Killick-Kendrick R. Phlebotomine vectors of the 

leishmaniases: a review, Med Vet Entomol. 1990. 4 

(1): 1-24. 

18. Nicolescu Gabriela. Flebotomii, in Insecte vectoare 

şi generatoare de disconfort, Edit Med Bucureşti, 

1986. 137-146. 

19. Ready P D. Leishmaniasis emergence in Europe. Euro 

Surveill. 2010. 15 (10): pii = 19505. Available online: 

http://www.eurosurveillance. org/ViewArticle 

.aspx?ArticleId=19505. 

20. Dujardin J-C, Campino L, Canavate Carmen, 

Dedet J-P, Gradoni L, Soteriadou Ketty, Mazeris 

A, Ozbel Y, Boelaert Marleen. Spread of vectorborne 

diseases and neglect of leishmaniasis, Europe, 

Emerg Inf Dis. 2008. 14, 7. 

21. Lindgren Elisabeth, Naucke T, Menne Bettina. 

Leishmaniasis in Europe, Sc Work Group, Report on 

Leishmaniasis, Geneva, WHO on behalf of the Special 

Programme for Research and Training in Tropical Diseases, 

2004. http://www.who.int/ tdr/publications/publications/swg_leish.htm. 

22. Antoniou M, Haralambous C, Mazeris A, Pratlong 

F, Dedet J-P, Soteriadou K. Leishmania donovani 

leishmaniasis in Cyprus. Lancet Infect Dis. 2008. 8, 

6-7. 

23. Antoniou M, Messaritakis I, Christodoulou V, Ascoksilaki 

I, Kanavakis N, Sutton A J, Carson C, 

Courtenay O, Increasing incidence of zoonotic visceral 

leishmaniasis on Crete, Greece, Emerg Infect 

Dis. 2009. 15 (6): 932-934. 

24. Martín-Sánchez Joaquina, Morales-Yuste M, 

Acedo-Sánchez Carmen, Barón S, Díaz V, Morillas-Márquez 

F. Canine Leishmaniasis in Southeastern 

Spain, Emerg Inf Dis. 2009. 15 (5): 795–798. 

25. Razzaghi Maensh M, Mahabadi S, Ghamesi A, 

Namjoo A R. Prevalence of canine visceral leishmaniasis 

in dogs at Adrestan District detected by PCR, 

Veter Res. 2012. 5: 22-25, DOI: 10.3923/ 

vr.2012.22.25, http://medwelljournals.com /abstract 

/?doi= vr.2012.22.25 

26. Chamaillé Lise, Tran Annelise, Meunier Anne, 

Bourdoiseau G, Ready P, Dedet J-P. Environmental 

risk mapping of canine leishmaniasis in France, Paras 

& Vect, 2010. 3: 31 doi:10.1186/1756-3305-3-31 

http://www.parasitesandvectors. com/content/ 3/1/31 

27. Cortes S, Vaz Y, Neves R, Maia C, Cardoso L, 

Campino L. Risk factors for canine leishmaniasis in 

an endemic Mediterranean region. Vet Parasitol. 2012. 

189 (2-4): 189-196. doi: 10.1016/j.vetpar. 

2012.04.028. 

28. Dereure J, Vanwambeke S O, Malé P, Martinez S, 

Pratlong F, Balard Y, Dedet J P. The potential effects 

of global warming on changes in canine leishmaniasis 

in a focus outside the classical area of the 

disease in southern France, Vect Borne Zoonotic Dis. 

2009. 9 (6): 687-694. 

29. Ferroglio E, Maroli M, Gastaldo S, Mignone W, 

Rossi L. Canine leishmaniasis, Italy. Emerg Infect Dis. 

2005. [serial on the Internet]. http://dx.doi.org/ 

10.3201/eid1110.040966 DOI: 10.3201/ 

eid1110.040966. 

30. Tánczos B, Balogh N, Király L, Biksi I, Szeredi L, 

Gyurkovsky M, Scalone A, Fiorentino E, Gramiccia 

M, Farkas R. First record of autochthonous canine 

leishmaniasis in Hungary. Vect Born Zoon Dis. 

2012. 12 (7): 588-594. doi: 10.1089/vbz.2011.0906. 

Epub 2012 May 18 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 

pubmed22607079. 

31. Olteanu Gh, Panaitescu D, Gherman I, Şuteu I, 

Cosoroabă I, Rădulescu Simona, Fazakaş B, Codreanu-Bălcescu 

Doina, Sârbu V, Popârlan N, 

Brănescu Viorica, Nicolae St, Ionescu V, Barcan 

Marilena, Mitrea L I, Ciucă N, Ştefănoiu V, Cristea 

Gh, Pavel Agneta. Parazitozoonoze, Probleme la 

sfârşit de mileniu în România, 1999. Edit Viaţa Med 

Rom, Bucureşti. 

32. Olteanu Gh, Panaitescu D, Gherman I, Zgardan 

E, Apatenko V, Fazakaş B, Codreanu-Bălcescu 

Doina, Teodorescu Irina, Iacobiciu I, Tălămbuţă 

Nina, Erhan D, Marx Madeleine, Cristea Gh, Junie 

Monica, Doicescu D. Poliparazitismul la om, animale 

şi plante, 2001. Edit Ceres, Bucureşti. 

33. Gherman I, Zaharia A L Const, Bîrzu I, Popescu 

Gh, Tiereanu E. Considerații epidemiologice asupra 

54


primului episod epidemic de leishmanioză infantilă în 

țara noastră, Microb Parazit şi Epid. 1957. 6, 556-560. 

34. Manicatide M. Sur deux cas de Kala-azar observés 

en Roumanie, Bull Sect Scient Acad Roum. VI-eme 

Annee, 1919/1920, 5-6, 105 -112. 

35. Minculescu M, Bîrzu I, Creţu S, Iovănescu F, 

Ionescu D, Lupulescu V, Michel G, Paulon S, Rotaru 

A, Rusovici I, Zaharia C. The first focus of infantile 

leishmaniasis identified in the Rumanian 

People’s Republic, Stud. şi cercet inframicrobiol. 

1955. 6 (3-4): 595-603. 

36. Ardeleanu Carmen, Zurac Sabina, Zaharia Anca, 

Vrabie Alexandra, Lavric Luciana, Andrei R, 

Stăniceanu Florica, Giurcăneanu C. Leishmanioza 

cutanată – probleme de diagnostic diferenţial, Terapeut, 

farmacol şi toxicol clinic. 2005. IX, 4, 99-103. 

37. Balea M L A, Guran M, Balea M I, Răzvan A. Diagnostic 

difficulties in imported leishmaniasis in Romania, 

12 th Congr Europ Hematol Assoc. 2007. 

38. Boda D, Cilievici Suzana, Diaconescu Adriana, 

Costache Mariana, Popescu Sanda. Leishmanioză 

cutanată la o fetiţă de 12 ani, Dermatovenerol. 2001. 

46, 4, 283. 

39. Erscoiu Simona, Voinea Cristina, Florescu S, 

Ceauşu E. Imported visceral leihmaniosis in Romania, 

Rev Rom Parazitol, 2004. XIV, 1, 89-91. 

40. Florescu S, Popescu C, Cotiga M, Răduţă L, Botgros 

R, Voinea C, Erscoiu S, Ceauşu E, Calistru P. 

Visceral leishmaniasis cases in Romania, 17th Europ 

Congr Clin Microbiol and Inf Dis. ICC, Munich, Germany. 

2007. 

41. Florescu S, Ceauşu E, Calistru P, Voinea Cristina, 

Turcu (Mozes) Elena, Nica Maria, Popescu C, 

Păun L. Imported tropical pathology in Romania in 

the last 11 years, Rev Rom de boli infecţioase, 2010. 

XIII, 1, 11-15. 

42. Găman Amelia, Dobrea Camelia, Găman G. A case 

of visceral leishmaniasis in Oltenia region (Romania), 

Rom Journ Morphol and Embryol. 2010. 51 (2): 391– 

394. 

43. Halichidis Stela, Rugină S, Dumea Elena. Leishmaniasis 

in travellers in endemic areas, 16th Europ Congr 

of Clin Microbiol and Infect Dis. Nice, France, April 

1-4. 2006. 

44. Ioncică N, Bărbulescu C M, Mertoiu G, Ciucă N. 

The statistic studying of the leishmaniosis in the Dobrogea 

area, between 2000-2005 (abstract), Rev Rom 

Parazitol. 2007. XVIII, 95. 

45. Lazăr Lidia, Schilo E A, Leventer Mihaela. Ecoepidemilogical 

and clinico-therapeurtic assessment on 

cutaneous leishmaniosis in Romania and Israel: case 

studies (abstract) Rev Rom Parazitol. 2008. XVIII, 

128-129. 

46. Neghină R, Neghină Adriana-Maria, Merkler Carmen, 

Marincu I, Moldovan Roxana, Iacobiciu I. 

Importation of visceral leishmaniasis in returning Romanian 

workers from Spain, Travel Med and Infect 

Dis. 2009. 7 (1): 35-39. 

47. Oniţă M, Hornung Edith, Ciobanu C, Sârbu A E, 

Olariu Teodora, Oniţă C, Stoica A L. Visceral leishmaniasis-surgical 

aspects, Chirurgia, 2006.101 (3): 

335-339. 

48. Patiu Mariana, Telcian Aurica, Petraşcu Mirela, 

Cucuianu A. Visceral leishmaniosis-a case presentation, 

Rev Rom Parazitol. (abstract) 2007. XVIII, Supliment, 

146. 

49. Rugină S, Dumitru Irina Magdalena, Cernat Ro - 

xana Carmen. Visceral leishmaniosis in actuality, abstract, 

Rev Rom Parazitol. 2008. XVIII, Supliment, 

204. 

50. Zurac Sabina, Zaharia Anca, Micu Gianina, 

Lavric Luciana, Tudose Irina, Preda Georgeta, 

Stăniceanu Florica, Giurcaneanu C. Leishmanioza 

cutanată – probleme de diagnostic diferenţial, The 

XXXVIth Nat Sympos Normal and Pathol Morphol. 

(abstract) 2005. 99. 

51. Dancesco P. Les espèces de phlébotomes (Diptera: 

Psychodidae) de Roumanie, certains aspects de leur 

écologie et nouvelles stations de capture, Trav Mus 

Nat Hist Nat «Gr. Antipa» 2008. LI, 185–199. 

55

DOUÃ RAPOARTe De CAZURI De LeIsHMANIOZÃ 

DIAGNOsTICATe ÎN ROMâNIA 

Marian Ghervan Gogoaşe 1 , Irina Teodorescu 2 *, 

Carmen Preda 1 , Simona Claudia Ionescu 3 

1 institutul Clinic Fundeni, 2 Universitatea din bucureşti, Facultatea de biologie, România 

3 spitalul Clinic de boli infecþioase şi tropicale „victor babeş“, bucureşti, România 

ReZUMAT 

În Institutul Clinic Fundeni au fost detectate două cazuri de leishmanioză viscerală produse de o specie 

din complexul Leishmania donovani. Într-unul dintre cazuri, pot fi presupuse două posibilităţi de infestare: 

în Italia, unde pacientul a lucrat cu trei ani în urmă, sau în România (judeţul Dolj) unde locuieşte 

şi unde, în trecut, au mai fost înregistrate unele cazuri de leishmanioză umană şi canină. În celălalt 

caz, pacientul locuia în nord-estul ţării (judeţul Iaşi), dar a lucrat în zona de sud-vest a României. În 

ambele cazuri există deci posibilitatea unei transmisii locale, care în viitor ar putea fi amplificată şi 

extinsă dacă se continuă procesul de creştere a valorilor temperaturii, care favorizează speciile vectoare 

autohtone şi alohtone de Phlebotomus. 

Cuvinte cheie: leishmaniozã visceralã, Leishmania, România 

INTRODUCERE 

Leishmanioza umană este una dintre cele mai 

importante boli cu transmisie vectorială, endemică 

în 88 de ţări (16 “dezvoltate” şi 72 “în curs de dezvoltare”) 

[1], cauzată de mai mult de 20 de specii şi 

tulpini, imposibil de distins morfologic, din genul de 

protozoare flagelate intracelulare Leishmania, subgenul 

Leishmania (Kinetoplastida, Trypanosomatidae). 

Organizaţia Mondială a Sănătăţii a clasificat-o 

în topul primelor zece maladii infecţioase [2] cu risc 

de mortalitate (OMS, 2001; 2010). Circa 350 de milioane 

de persoane sunt expuse riscului de infecţie, 

cu o incidenţă anuală globală de 1-1,5 milioane pentru 

leishmanioza cutanată şi 500.000 pentru cea viscerală, 

cu circa 50 de mii de decese [3]. 

Manifes tările clinice ale bolii se înscriu în trei forme 

majore: viscerale, cutaneo-mucoase şi cutanate (conform 

celui de al VII-a Raport de Cercetare privind 

Bolile Tropicale), uneori cu tablou diseminat. 

Agentul etiologic al leishmaniozei viscerale este 

complexul Leishmania Leishmania donovani, care 

conform studiilor anterioare cuprinde patru specii: 

L. (L.) donovani sensu stricto, L. (L.) infantum, L. 

(L.) chagasi şi L. (L.) archibaldi. În studiile recente, 

sunt considerate trei specii: L. (L.) donovani sensu 

stricto, în Africa de Est, L. (L.) infantum în Europa, 

Africa, China, America Latină (în ultima regiune numită 

L. chagasi) şi L. (L.) archibaldi în Africa de Est 

[4]. Alţi autori consideră două specii: L. (L.) infantum, 

în Europa, nordul Africii, America de Sud şi 

Centrală, şi L. (L.) donovani sensu stricto, în estul 

Africii, India şi părţi din Orientul Mijlociu [5]. În 

genul Leishmania, subgenul Leishmania, au fost stabilite 

cinci specii: L. (L.) donovani, L. (L.) major, L. 

(L.) tropica, şi L. (L.) mexicana [6]. În specia L. (L.) 

donovani este inclusă şi specia L. (L.) donovani infantum. 

Leishmanioza viscerală (LV) este o infecţie 

oportunistă asociată cu diferite condiţii de imunodeficienţă: 

infecţie cu HIV, neoplasme, transplant de 

organe şi tratament pe termen lung cu medicamente 

imunosupresoare. LV este o complicaţie frecventă la 

pacienţii cu SIDA care trăiesc în zone endemice pentru 

Leishmania [7]. Coinfecţia cu Leishmania şi virusul 

imunodeficienţei umane (HIV) [8, 9], ambele 

infectând macrofagele, duce la o creştere drastică a 

severităţii cazurilor de leishmanioză. Primul caz de 

leishmanioză asociat cu HIV a fost raportat în 1985, 

iar ulterior mai multe cazuri de coinfecţie au fost ra- 

*autor corespondent: irina teodorescu, Universitatea din bucureşti, Facultatea de biologie, România, e-mail: teodorescubiologie@yahoo.com 

56

Douã rapoarte de cazuri de leishmaniozã diagnosticate în România 

portate din peste 35 de ţări din întreaga lume, majoritatea 

în sud-vestul Europei [10, 11, 12]. Această coinfecţie 

a devenit endemică în multe zone din sudul 

Europei, mai mult de 25-75% din cazurile de leish - 

manioză viscerală fiind detectate la adulţi infectaţi 

cu HIV [13]. La persoanele cu imunodepresie 

(SIDA), leishmanioza, iniţial asimptomatică, poate 

evolua către forme clinice severe, coinfecţia accelerând 

şi agravând atât SIDA, cât şi simptomele leish - 

maniozei. Conform Organizaţiei Mondiale a 

Sănătăţii (2012) „Cele două boli se susţin reciproc: 

persoanele infectate cu HIV sunt deosebit de vulnerabile 

la LV, în timp ce LV accelereaza replicarea 

HIV şi progresia infecţiei către SIDA”. Această coinfecţie 

ar putea avea consecinţe majore şi pentru 

băncile de sânge. A fost demonstrat că donatorii de 

sânge asimptomatici care trăiesc în sudul Franţei au 

avut seropozitivitate pentru leishmanioză de 3,4%, 

în Grecia de 15% şi în Spania, 22,1% [14, 15, 16]. 

Vectorii pentru speciile de Leishmania sunt Dipterele 

Psychodidae (muşte de nisip) care în Europa, 

Africa şi Asia aparţin genului Phlebotomus şi în 

America, genului Lutzomyia [17, 18]. 

În sudul Europei sunt prezente leishmanioza 

viscerală (cu numeroase cazuri, periculoase şi letale 

dacă nu sunt tratate) şi leishmanioza cutanată (mai 

benignă) [19]. Incidenţa leishmaniozei umane este 

relativ scăzută (8,53 de cazuri la 100.000 de persoane, 

cele mai multe cazuri fiind înregistrate în Turcia).Cazuri 

de LV au fost raportate în Albania, 

Bosnia, Croaţia, Cipru, Franţa (regiunile de sud), 

Grecia, Ungaria, Macedonia, Malta, Muntenegru, 

Portugalia, România, Spania, Serbia şi Muntenegru 

şi Turcia. În ultimul timp, LV s-a răspândit spre nord, 

aşa cum se arată în rapoartele recente referitoare la 

cazuri indigene din nordul Italiei şi sudul Germaniei. 

În fiecare an, au fost raportate aproximativ 3.950 de 

cazuri umane autohtone (700 exclusiv Turcia), dar la 

fiecare caz simptomatic au fost estimate 30-100 cazuri 

asimptomatice [20]. În ultimii ani, a crescut proporţia 

cazurilor de leishmanioză viscerală la adulţi 

(în special HIV-pozitivi, dar şi la persoane HIV-negative), 

în timp ce în trecut, aceasta boală era caracteristică 

pentru copii [21]. Primele cazuri autohtone 

din Europa, considerate ca fiind infecţii cu L. donovani, 

au fost detectate în Cipru [22, 23]. 

L. (L.) infantum infectează şi câinii, reprezentând 

o cauză importantă de mortalitate (cu o seroprevalenţă 

de până la 25% în sudul Europei, până la 

34% în zone foarte endemice din Spania [24], şi 

aproximativ 5.000 de cazuri clinice în fiecare an în 

Franţa). Câinii, simptomatici sau asimptomatici [25] 

constituie un important rezervor pentru acest parazit, 

de la care vectorii din genul Phlebotomus se pot infecta 

şi transmit infecţia la om [26-30]. Un alt risc 

este reprezentat de posibilitatea ca L. (L). infantum 

să fie exportată în afara Europei prin câinii infectaţi. 

Cazuri de leishmanioză cutanată cu L. (L.) 

major, L. (L.) tropica şi chiar L. (L.) infantum ca 

agenţi etiologici au fost raportate în Albania, Austria, 

Bosnia şi Herţegovina, Bulgaria, Croaţia, Cipru, 

Franţa, Grecia, Italia, Malta, Monaco, Portugalia, 

România, Spania (inclusiv Insulele Canare), Serbia 

şi Muntenegru. 

În România, Olteanu şi colab. [31, 32] au menţionat 

unii autori (Copăceanu et al, 1955; Bârzu et 

al, 1956; Lupaşcu et al, 1963; Zaharia, 1972; Wahirapp 

et al, 1976; Diaconu, 1981) care au diagnosticat 

leishmanioză viscerală şi cutanată. Alte relatări referitoare 

la leishmanioză în România au fost făcute 

între 1919 şi 1958 [33, 34, 35]. Au fost de asemenea 

recent detectate unele cazuri de leishmanioză viscerală 

şi cutanată de import (la călători sau lucrători în 

zone endemice) [36-50]. 

MATERIALE ŞI METODE 

Investigaţiile au fost efectuate la doi pacienţi internaţi 

în 2007 la Institutul Clinic Fundeni. Examenele 

citologice şi histologice ale biopsiei hepatice au 

fost efectuate pe preparate colorate Van Gieson, coroborate 

cu rezultatele investigaţiilor clinice, cum ar 

fi examene fizice, biochimice, hematologice, ultrasonografie 

abdominală, radiografii toracice şi teste 

bacteriologice. Anamneza a oferit şi informaţii epidemiologice. 

REZULTATE 

Cazul I 

Pacient de sex masculin de 23 de ani, din Radovan, 

judetul Dolj, care a lucrat în Italia cu trei ani în 

urmă, a fost internat la Institutul Clinic Fundeni acuzând 

durere în hipocondrul stâng abdominal de o 

lună, descrisă ca o senzaţie de înţepătură şi durere 

apărută la efort în hipocondrul drept, însoţite de pierdere 

marcată în greutate (16 kg). La diagnosticul preliminar, 

au fost luate în consideraţie leptospiroza şi 

septicemia secundară unei orhiepididimite acute. 

Rezultate de laborator şi investigaţii specifice: 

i) hemoleucograma a evidenţiat pancitopenie 

(leucocite 2.600, hemoglobina 8,0 g/dl, trombocite 

81.000), cu anizocitoză moderată (microcite), hipocromie 

moderată şi eritrocite în „ochi de bou”, cu o 

tendinţă de formare de cilindri; ii) VSH 50 mm/oră; 

57


iii), fibrinogen normal; iv) valori crescute ale enzimelor 

hepatice: GGT = 201 μ /1, ALT = 154 μ / 1. 

Hemocultura a fost pozitivă cu stafilococi coagulazo-negativi, 

RPR negativ, formula leucocitară: 

neutrofile 47%, limfocite 45%, monocite 2%, mielocite 

6%, VHB şi VHC negativ, IgG anti-CMV 

151.3/15 (pozitiv) şi IgM anti-CMV 0.190/0.500 

(negativ). 

Ultrasonografia abdominală a relevat steatoză 

hepatică de gradul I cu structură hiperechoică, cu caracter 

granular, axa spleno-portală, vezica biliară şi 

pancreasul în limite normale, splina cu aspect neregulat, 

cu vene uşor extinse în hilus, fără ascită în peritoneu, 

spaţiul retroperitoneal normal. Radiografia 

toracică era normală. 

Biopsia măduvei osoase din osul iliac a arătat 

celularitate bogată, cu predominanţa granulocitelor 

mature, frecvente limfocite mature (17%) şi frecvente 

plasmocite reactive (6%). Linia de celule roşii 

a fost normoblastică. Au fost evidenţiate megacariocite, 

cu trombocitoformare uşor redusă. Biopsia de 

măduvă osoasă a evidenţiat o măduvă hipercelulară 

cu o uşoară plasmocitoză. 

Biopsia hepatică (fragment de ~ 8mm lungime) 

a evidenţiat prezenţa unui ţesut hepatic cu arhitectură 

lobulară normală, cu spaţiile portale moderat mărite, 

cu granulom de infiltrat inflamator limfo-plasmocitar 

şi rare celule epitelioide şi celule gigante multinucleate, 

fără fibroză portală, cu rare imagini de 

hemofagocitoză. Intralobular s-a evidenţiat infiltrat 

intrasinusoidal cronic, hipertrofia şi hiperplazia celulelor 

Kupffer, granuloame formate din macrofage 

şi celule epitelioide. Au fost vizibile foarte mici incluziuni 

bazofile macrofagocitice (1-2 microni in 

diametru), unele cu un halou clar, indicând prezenţa 

amastigoţilor de Leishmania spp. (Fig. 1, 2 

şi 3). 

Cazul II 

Pacient de sex masculin de 35 de ani, cu domiciliul 

în Româneşti, judeţul Iaşi, a fost internat în Clinica 

de Gastroenterologie a Institutului Clinic 

Fundeni în urma unui transfer de la o clinică de boli 

infecţioase din Iaşi, unde pacientul a fost spitalizat 

o lună, cu un sindrom febril prelungit (40-41 0 C), fără 

răspuns la antibioterapie intravenoasă. Diagnosticul 

preliminar a fost de splenomegalie cu hipersplenism, 

cu suspiciune de chist hidatic splenic. După zece zile 

de investigaţii şi antibioterapie intravenoasă din 

cauza unui debut de insuficienţă respiratorie hipoxemică, 

pacientul a fost internat la terapie intensivă. 

La admiterea în terapie intensivă, pacientul a fost febril 

(39,6 0 C), polipneic şi tahicardic, cu icter şi echimoze 

la locul puncţiei venoase. 

Rezultate de laborator şi investigaţii specifice: 

hemoleucograma a evidenţiat pancitopenie severă 

cu 1.200 de leucocite, anemie cu hemoglobină 

6,3 g/dl şi niveluri foarte ridicate ale enzimelor hepatice, 

ESR 1 LOmm/oră, trombocitopenie de 

14.000. Examenul microscopic al ţesutului hepa- 

Fig. 1 - Biopsie de ţesut hepatic: histiocite cu amastigote de Leishmania 

(ob. 100× imersie, frotiu Giemsa) 

58



(ob. 100× imersie, frotiu Giemsa) 

tic a relevat prezenţa de incluziuni bazofile, caracteristică 

pentru infecţia cu Leishmania spp. 

Serologia pentru Leishmania (efectuată la Spitalul 

Clinic de Boli Infecţioase şi Tropicale „Dr. Victor 

Babeş”) a fost pozitivă, confirmând infecţia. Insuficienţă 

renală acută a debutat după patru zile de tratament, 

cu semne de necroză tubulară acută. 

Funcţiile renale au revenit la normal prin hemofiltrare 

şi hemodializă, ca şi funcţiile hepatice. În timpul 

spitalizării, după ce starea pacientului s-a 

îmbunătăţit, s-a efectuat o splenectomie pentru un 

chist hidatic splenic de dimensiuni mari (inactivare, 

evacuare, pericistectomie). Polineuropatia cu tetraplegie 

a persistat şi starea neurologică s-a înrăutăţit. 


(ob. 100× imersie, frotiu Giemsa) (procesare digitală) 

59


Pacientul a dezvoltat un sepsis sever din cauza pneumoniei 

de ventilaţie, cu insuficienţă renală acută şi 

exitus. 

DISCUÞII 

Caracteristicile tipice, clinice şi de laborator 

pentru leishmanioză viscerală includ febră mare, 

hepatosplenomegalie, pancitopenie şi hipergamaglobulinemie, 

implicând majoritatea organelor. 

În cazul primului pacient, care a lucrat în Italia, 

pot fi luate în consideraţie două posibilităţi de infecţie: 

din Italia, o zonă endemică pentru leishmanioză, 

sau contaminare de la o sursă autohtonă, adică în Oltenia, 

unde trăia pacientul. În apropierea Craiovei, 

în sud-vestul judeţului Dolj, au fost înregistrate câteva 

cazuri de leishmanioză umană, în 1912, 1945, 

1953-1954 şi în judeţul Caraş-Severin au fost semnalate 

unele cazuri de leishmanioză canină, în 1929 

şi 1957. În aceste zone a fost semnalată de asemenea 

prezenţa unor specii de Phlebotomus posibili vectori 

pentru Leishmania [51]. 

Pentru al doilea pacient, care locuia în zona de 

nord-est a ţării (judeţul Iaşi), nici o sursă de infecţie 

locală nu este documentată, dar acesta a lucrat în 

zona de sud-vest a României, unde au fost semnalate 

cazuri de leishmanioză umană, aşa că ar putea fi 

luată în considerare posibilitatea existenţei unei 

surse autohtone de infecţie. 

CONCLUZII 

În Institutul Clinic Fundeni au fost investigate 

două cazuri de leishmanioză viscerală. Deşi într-unul 

dintre cazuri este probabilă o leishmanioză de import, 

în ambele cazuri poate fi luată în considerare şi 

o sursă autohtonă de infecţie (în zona de sud-vest a 

României). 

La pacientul care a lucrat în Italia, prezentarea 

clinică sugestivă, asociată cu istoricul său de călătorie 

a putut conduce la un diagnostic rapid de leish - 

manioză viscerală. Rezultatele de laborator şi alte 

investigaţii specifice (sindrom febril, pancitopenie, 

incluziuni bazofile de 1-2 microni în ţesutul hepatic 

care indică prezenţa amastigoţilor de Leishmania 

spp.) au confirmat diagnosticul. 

În cazul celui de-al doilea pacient, rezident în 

zona de nord-est a ţării (judeţul Iaşi), examenul microscopic 

al ţesutului hepatic a indicat prezenţa 

amastigoţilor de Leishmania spp., infecţia fiind 

confirmată şi serologic. Leishmanioza cu febră 

foarte ridicată, pancitopenie şi anemie severe, însoţită 

de alte semne clinice (insuficienţă respiratorie 

hipoxemică, chist hidatic splenic mare şi splenectomia 

consecutivă, insuficienţa renală acută cu necroză 

tubulară, infecţia pulmonară şi sepsisul sever) au generat 

un prognostic sever şi decesul. 

Cele două cazuri diagnosticate reprezintă un 

semnal de alarmă, deoarece în contextul schimbărilor 

climatice globale, cu o tendinţă de încălzire continuă, 

care favorizează înmulţirea speciilor autohtone 

de Phlebotomus, dar şi posibilitatea de penetrare în 

România a altor specii de Phlebotomus care sunt 

vectori pentru Leishmania, creşte riscul ca România 

să devină o zonă endemică pentru leishmanioză. 

BIBLIOGRAFIE 

1. Desjeux P, Alvar J. Leishmania/HIV co-infections: 


97 (1): 3-15. 

2. World Health Organization. WHO Techical Report Series: 

control of the leishmaniasis. Report of a meeting 

of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniases. 

World Health Organization: Geneva; 22-26 

March 2010. 

3. Ezra N, Ochoa Maria Teresa, Craft N. Human Immu - 

nodeficiency Virus and Leishmaniasis, J Glob Infect Dis. 

2010. 2 (3): 248–257. doi: 10.4103/0974-777X.68528. 

4. Quispe-Tintaya, KW, Laurent T, Decuypere Saskia, 

Hide Mallorie, Banuls Anne-Laure, De Doncker Simonne, 

Rijal S, Canavate Carmen, Campino L, Dujardin1 

J-C. Fluorogenic Assay for Molecular Typing 

of the Leishmania donovani Complex: Taxonomic and 

Cli nical Applications, The Jour Inf Dis. 2005. 192: 685– 

692. 

5. Lukeš J, Mauricio L Isabel, Schönian Gabriele, Dujardin 

J-Cl, Soteriadou Ketty, Dedet J P, Kuhls Katrin, 

Quispe Tintaya K W, Jirků M, Chocholová 

Eva, Haralambous C, Pratlong Francine, Oborník 

M, Horák A, Ayala F J, Miles M A. Evolutionary and 

geographical history of the Leishmania donovani complex 

with a revision of current taxonomy, Proc Nat 

Acad Sci USA. 2007. 104 (22): 9375-9380. 

6. Fraga J, Montalvo A M, De Doncker S, Dujardin J 

C, Van der Auwera G. Phylogeny of Leishmania species 

based on the heat-shock protein 70 gene, Infect 

Genet Evol. 2010. 10 (2): 238-245. doi: 10.1016/ j.meegid.2009.11.007. 

Epub 2009 Nov 11. 

7. Cota F Glaucia, de Sousa M R, Rabello Ana. Predictors 

of Visceral Leishmaniasis Relapse in HIV-Infected 

Patients: A Systematic Review. PLOS Neg Trop Dis. 

2011. 5, 6: e1153. doi:10.1371/journal.pntd.0001153. 

8. Agostoni C, Dorigoni N, Malfitano A, Caggese L, 

Marchetti G, Corona S, Gatti S, Scaglia M. Mediterranean 

leishmaniasis in HIV–infected patient: epidemiological, 

clinical, and diagnostic features of 22 cases. 

Infection, 1998. 26, 2, 93-9. 

9. Leishmaniasis and HIV coinfection WHO 2012 

http://www.who.int/leishmaniasis/burden/hiv_coinfection/burden_ 

hiv_coinfection/en/index.html. 

60


10. Alvar J, Canavate C, Gutierrez-Solar B, Jimenez 

M, Laguna F, Lopez-Velez R, Molona R, Moreno 

J. Leishmania and human immunodeficiency virus coinfection: 

the first years, Clin Microbiol Rev. 1997. 

10, 2, 298-319. 

11. Desjeux P, Alvar J, Leishmania/HIV co-infections: 


97, Suppl. 1, 3–15. 

12. Gradoni L, Gaeta G B, Pellizzer G, Maisto A, Scalone 

A. Mediterranean visceral leishmaniasis in pregnancy, 

Scand Journ Inf Dis. 1994. 26 (5): 627-629. 

13. Maguire J H, Leishmania, a Parasite on the Move, in 

Scheld W M, Craig W A, Hughes J M. Emerg Inf. 

1999. 99-111, ASM Press, Washington D.C. 

14. Le Fichoux Y, Quaranta J G, Aufeuvre J P, Lelievre 

A, Marty P, Suffia I. Occurrence of Leishmania 

infantum parasitemia in asymptomatic blood donors 

living in an area of endemicity in southern France, J 

Clin Microbiol. 1999. 37: 1953–1957. 

15. Riera Cristina, Fisa R, Udina M, Gállego M, Portus 

M. Detection of Leishmania infantum cryptic infection 

in asymptomatic blood donors living in an 

endemic area (Balearic Islands, Spain) by different 

diagnostic methods. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2004. 

98: 102-110. http://dx.doi.org/101016/S0035- 

9203(03)0015-4. 

16. Riera Cristina, Fisa R, López-Chejade P, Serra Teresa, 

Girona E, Jiménez MaTeresa, Muncunill J, 

Sedeño Matilde, Mascaró M, Udina Maria, Gállego 

M, Carrió J, Forteza A, Portús M. Asymptomatic 

infection by Leishmania infantum in blood donors 

from the Balearic Islands (Spain), Transfusion, 2008. 

48 (7): 1383-1389. DOI: 10.1111/j.1537- 

2995.2008.01708.x. 

17. Killick-Kendrick R. Phlebotomine vectors of the 

leishmaniases: a review, Med Vet Entomol. 1990. 4 

(1): 1-24. 

18. Nicolescu Gabriela. Flebotomii, in Insecte vectoare 

şi generatoare de disconfort, Edit Med Bucureşti, 

1986. 137-146. 

19. Ready P D. Leishmaniasis emergence in Europe. Euro 

Surveill. 2010. 15 (10): pii = 19505. Available online: 

http://www.eurosurveillance. org/ViewArticle 

.aspx?ArticleId=19505. 

20. Dujardin J-C, Campino L, Canavate Carmen, 

Dedet J-P, Gradoni L, Soteriadou Ketty, Mazeris 

A, Ozbel Y, Boelaert Marleen. Spread of vectorborne 

diseases and neglect of leishmaniasis, Europe, 

Emerg Inf Dis. 2008. 14, 7. 

21. Lindgren Elisabeth, Naucke T, Menne Bettina. 

Leishmaniasis in Europe, Sc Work Group, Report on 

Leishmaniasis, Geneva, WHO on behalf of the Special 

Programme for Research and Training in Tropical Diseases, 

2004. http://www.who.int/ tdr/publications/publications/swg_leish.htm. 

22. Antoniou M, Haralambous C, Mazeris A, Pratlong 

F, Dedet J-P, Soteriadou K. Leishmania donovani 

leishmaniasis in Cyprus. Lancet Infect Dis. 2008. 8, 

6-7. 

23. Antoniou M, Messaritakis I, Christodoulou V, Ascoksilaki 

I, Kanavakis N, Sutton A J, Carson C, 

Courtenay O, Increasing incidence of zoonotic visceral 

leishmaniasis on Crete, Greece, Emerg Infect 

Dis. 2009. 15 (6): 932-934. 

24. Martín-Sánchez Joaquina, Morales-Yuste M, 

Acedo-Sánchez Carmen, Barón S, Díaz V, Morillas-Márquez 

F. Canine Leishmaniasis in Southeastern 

Spain, Emerg Inf Dis. 2009. 15 (5): 795–798. 

25. Razzaghi Maensh M, Mahabadi S, Ghamesi A, 

Namjoo A R. Prevalence of canine visceral leishmaniasis 

in dogs at Adrestan District detected by PCR, 

Veter Res. 2012. 5: 22-25, DOI: 10.3923/ 

vr.2012.22.25, http://medwelljournals.com /abstract 

/?doi= vr.2012.22.25 

26. Chamaillé Lise, Tran Annelise, Meunier Anne, 

Bourdoiseau G, Ready P, Dedet J-P. Environmental 

risk mapping of canine leishmaniasis in France, Paras 

& Vect, 2010. 3: 31 doi:10.1186/1756-3305-3-31 

http://www.parasitesandvectors. com/content/ 3/1/31 

27. Cortes S, Vaz Y, Neves R, Maia C, Cardoso L, 

Campino L. Risk factors for canine leishmaniasis in 

an endemic Mediterranean region. Vet Parasitol. 2012. 

189 (2-4): 189-196. doi: 10.1016/j.vetpar. 

2012.04.028. 

28. Dereure J, Vanwambeke S O, Malé P, Martinez S, 

Pratlong F, Balard Y, Dedet J P. The potential effects 

of global warming on changes in canine leishmaniasis 

in a focus outside the classical area of the 

disease in southern France, Vect Borne Zoonotic Dis. 

2009. 9 (6): 687-694. 

29. Ferroglio E, Maroli M, Gastaldo S, Mignone W, 

Rossi L. Canine leishmaniasis, Italy. Emerg Infect Dis. 

2005. [serial on the Internet]. http://dx.doi.org/ 

10.3201/eid1110.040966 DOI: 10.3201/ 

eid1110.040966. 

30. Tánczos B, Balogh N, Király L, Biksi I, Szeredi L, 

Gyurkovsky M, Scalone A, Fiorentino E, Gramiccia 

M, Farkas R. First record of autochthonous canine 

leishmaniasis in Hungary. Vect Born Zoon Dis. 

2012. 12 (7): 588-594. doi: 10.1089/vbz.2011.0906. 

Epub 2012 May 18 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed22607079. 

31. Olteanu Gh, Panaitescu D, Gherman I, Şuteu I, 

Cosoroabă I, Rădulescu Simona, Fazakaş B, Codreanu-Bălcescu 

Doina, Sârbu V, Popârlan N, Brănescu 

Viorica, Nicolae St, Ionescu V, Barcan 

Marilena, Mitrea L I, Ciucă N, Ştefănoiu V, Cristea 

Gh, Pavel Agneta. Parazitozoonoze, Probleme la sfârşit 

de mileniu în România, 1999. Edit Viaţa Med Rom, 

Bucureşti. 

32. Olteanu Gh, Panaitescu D, Gherman I, Zgardan 

E, Apatenko V, Fazakaş B, Codreanu-Bălcescu 

Doina, Teodorescu Irina, Iacobiciu I, Tălămbuţă 

Nina, Erhan D, Marx Madeleine, Cristea Gh, Junie 

Monica, Doicescu D. Poliparazitismul la om, animale 

şi plante, 2001. Edit Ceres, Bucureşti. 

33. Gherman I, Zaharia A L Const, Bîrzu I, Popescu 

Gh, Tiereanu E. Considerații epidemiologice asupra 

primului episod epidemic de leishmanioză infantilă în 

țara noastră, Microb Parazit şi Epid. 1957. 6, 556-560. 

34. Manicatide M. Sur deux cas de Kala-azar observés 

en Roumanie, Bull Sect Scient Acad Roum. VI-eme 

Annee, 1919/1920, 5-6, 105 -112. 

61


35. Minculescu M, Bîrzu I, Creţu S, Iovănescu F, Ionescu 

D, Lupulescu V, Michel G, Paulon S, Rotaru 

A, Rusovici I, Zaharia C. The first focus of infantile 

leishmaniasis identified in the Rumanian People’s Republic, 

Stud. şi cercet inframicrobiol. 1955. 6 (3-4): 

595-603. 

36. Ardeleanu Carmen, Zurac Sabina, Zaharia Anca, 

Vrabie Alexandra, Lavric Luciana, Andrei R, Stăniceanu 

Florica, Giurcăneanu C. Leishmanioza cutanată 

– probleme de diagnostic diferenţial, Terapeut, 

farmacol şi toxicol clinic. 2005. IX, 4, 99-103. 

37. Balea M L A, Guran M, Balea M I, Răzvan A. 

Diagnostic difficulties in imported leishmaniasis in 

Romania, 12 th Congr Europ Hematol Assoc. 2007. 

38. Boda D, Cilievici Suzana, Diaconescu Adriana, 

Costache Mariana, Popescu Sanda. Leishmanioză 

cutanată la o fetiţă de 12 ani, Dermatovenerol. 2001. 

46, 4, 283. 

39. Erscoiu Simona, Voinea Cristina, Florescu S, 

Ceauşu E. Imported visceral leihmaniosis in Romania, 

Rev Rom Parazitol, 2004. XIV, 1, 89-91. 

40. Florescu S, Popescu C, Cotiga M, Răduţă L, Botgros 

R, Voinea C, Erscoiu S, Ceauşu E, Calistru P. 

Visceral leishmaniasis cases in Romania, 17th Europ 

Congr Clin Microbiol and Inf Dis. ICC, Munich, Germany. 

2007. 

41. Florescu S, Ceauşu E, Calistru P, Voinea Cristina, 

Turcu (Mozes) Elena, Nica Maria, Popescu C, 

Păun L. Imported tropical pathology in Romania in 

the last 11 years, Rev Rom de boli infecţioase, 2010. 

XIII, 1, 11-15. 

42. Găman Amelia, Dobrea Camelia, Găman G. A case 

of visceral leishmaniasis in Oltenia region (Romania), 

Rom Journ Morphol and Embryol. 2010. 51 (2): 391– 

394. 

43. Halichidis Stela, Rugină S, Dumea Elena. Leishmaniasis 

in travellers in endemic areas, 16th Europ Congr 

of Clin Microbiol and Infect Dis. Nice, France, April 

1-4. 2006. 

44. Ioncică N, Bărbulescu C M, Mertoiu G, Ciucă N. 

The statistic studying of the leishmaniosis in the Dobrogea 

area, between 2000-2005 (abstract), Rev Rom 

Parazitol. 2007. XVIII, 95. 

45. Lazăr Lidia, Schilo E A, Leventer Mihaela. Ecoepidemilogical 

and clinico-therapeurtic assessment on 

cutaneous leishmaniosis in Romania and Israel: case 

studies (abstract) Rev Rom Parazitol. 2008. XVIII, 

128-129. 

46. Neghină R, Neghină Adriana-Maria, Merkler Carmen, 

Marincu I, Moldovan Roxana, Iacobiciu I. 

Importation of visceral leishmaniasis in returning Romanian 

workers from Spain, Travel Med and Infect 

Dis. 2009. 7 (1): 35-39. 

47. Oniţă M, Hornung Edith, Ciobanu C, Sârbu A E, 

Olariu Teodora, Oniţă C, Stoica A L. Visceral leishmaniasis-surgical 

aspects, Chirurgia, 2006.101 (3): 

335-339. 

48. Patiu Mariana, Telcian Aurica, Petraşcu Mirela, 

Cucuianu A. Visceral leishmaniosis-a case presentation, 

Rev Rom Parazitol. (abstract) 2007. XVIII, Supliment, 

146. 

49. Rugină S, Dumitru Irina Magdalena, Cernat Ro - 

xa na Carmen. Visceral leishmaniosis in actuality, abstract, 

Rev Rom Parazitol. 2008. XVIII, Supliment, 204. 

50. Zurac Sabina, Zaharia Anca, Micu Gianina, Lavric 

Luciana, Tudose Irina, Preda Georgeta, Stăniceanu 

Florica, Giurcaneanu C. Leishmanioza 

cutanată – probleme de diagnostic diferenţial, The 

XXXVIth Nat Sympos Normal and Pathol Morphol. 

(abstract) 2005. 99. 

51. Dancesco P. Les espèces de phlébotomes (Diptera: 

Psychodidae) de Roumanie, certains aspects de leur 

écologie et nouvelles stations de capture, Trav Mus 

Nat Hist Nat «Gr. Antipa» 2008. LI, 185–199. 

62

ADeNYLATe CYCLAses INVOLVeMeNT IN PATHOGeNICITY, 

A MINIReVIeW 

Adriana Costache*, Nadia Bucurenci, Adrian Onu 

Laboratory of Enzymologyy and applied microbiology, Cantacuzino national institute 

of Research-development for microbiology and immunology, bucharest, Romania 

ABsTRACT 

Cyclic AMP (cAMP), one of the most important secondary messengers, is produced by adenylate cyclase 

(AC) from adenosine triphosphate (ATP). AC is a widespread enzyme, being present both in 

prokaryotes and eukaryotes. Although they have the same enzymatic activity (ATP cyclization), the 

structure of these proteins varies, depending on their function and the producing organism. Some 

patho genic bacteria utilize these enzymes as toxins which interact with calmodulin (or another eukaryote 

activator), causing intense cAMP synthesis and disruption of infected cell functions. In contrast, 

other pathogenic bacteria benefit of augmentation of AC activity for their own function. 

Based on sequence analysis of AC catalytic domain from two pathogenic bacteria (Bacillus anthracis 

and Bordetella pertussis) with known three-dimensional structures, a possible secondary structure for 

1-255 amino acid fragment from Pseudomonas aeruginosa AC (with 80 TKGFSVKGKSS 90 as the ATP 

binding site) is proposed. 

Keywords: adenylate cyclase, calmodulin, cAMP, toxin 

INTRODUCTION 

Adenylate cyclases (AC) (E.C.4.6.1.1) are ubi - 

quitous enzymes responsible for the synthesis of 

cyclic AMP (adenosine 3’,5’-cyclic monophosphate, 

cAMP) from adenosine triphosphate (ATP). 

In eukaryotic cells, cAMP is one of the most important 

secondary messengers. It is involved in many 

cellular processes and controls cellular functions 

such as carbohydrate and lipid metabolism. The 

cAMP intracellular concentration is regulated by 

adenylate cyclases and phosphodiesterases. Certain 

pathogenic bacteria exploit this mechanism by using 

ACs as exotoxins to increase concentration of cAMP 

in infected cells and thus cause severe metabolic disturbances 

and cell death. A well documented case is 

that of Bacillus anthracis or Bordetella pertussis 

AC, which are injected into eukaryotic cells and activated 

by calmodulin (CaM) to generate cAMP. 

On the other hand, in many bacteria, cAMP 

functions as a regulator of transcription activation 

with an important role in microorganism adaptation 

and pathogenicity. 

ACs have been initially divided into three main 

classes, based on sequence similarities [1]: 

l Class I (the enterobacterial class) includes entero - 

bacterial pathogens such as Escherichia coli, Salmonella 

typhimurium and Yersinia pestis and 

Gram-negative bacteria (e.g. Vibrio cholerae and 

Aeromonas hydrophila) ACs [2]; 

l Class II includes secreted ACs from pathogenic 

bacteria (e.g. Bacillus anthracis, Bordetella pertussis, 

Pseudomonas aeruginosa, Yersinia pestis) 

as components of toxins; 

l Class III includes ACs from many organisms. This 

class is the largest and includes enzymes that respond 

to extracellular signals: hormones, neurotransmitters, 

chemokines etc.; 

As genome sequencing progressed, this classification 

was extended to six classes: 

l Class IV includes AC from Aeromonas hydrophila 

[3] and Yersinia pestis [4]; 

l Class V includes AC from Prevotella ruminicola 

(anaerobic bacteria from rumen) [5]. 

l Class VI includes an AC from Rhizobium etli [6]. 

*Corresponding author: Adriana Costache, Cantacuzino NIRDMI, Bucharest, Romania, email: adriana_rad@yahoo.com 

63

COSTACHE et al. 

In this paper we shall focus on the first three 

classes of AC. 

ADENYLATE CYCLASES FROM GRAM- 

NEGATIVE BACTERIA (CLASS I ADENYLATE 

CYCLASES) 

Many Gram-negative bacteria (e.g. Enterobacteria) 

are pathogenic. Unlike other ACs, Class I ACs 

are not activated by cellular factors such as CaM. 

They have other activators, most of them metabolic 

ones, demonstrating their role in their own metabolism. 

For instance, full activation of Brevibacterium 

liquefaciens AC requires pyruvate and the Esche - 

richia coli AC is inhibited by NaF, pyrophosphate, 

some nucleoside triphosphate and pyridoxal-phosphate 

[7]. 

The most studied member of this class is the Escherichia 

coli AC, encoded by cya gene. There are 

three promoters that control Escherichia coli cya 

translation. Although cya is poorly translated in vivo 

[7], cya promoter activity varies with the environmental 

carbon source and, in the presence of large 

amounts of exogenous cAMP, it decreases greatly 

[8]. AC is also repressed in the presence of cAMP 

receptor protein-cAMP complex, that binds to the 

operator region of the promoter cyaP2 [9]. However, 

the cells require a very strict control of cya expression, 

as an increase of six fold than normal may be 

lethal [10]. 

Escherichia coli AC is a protein with 848 aa and 

a pI of 6.1. It has a 395 amino acids N-terminal domain, 

which contains the active catalytic center, and 

a region corresponding to the C-terminal regulator 

domain. In fact, the entire class of enterobacteria AC 

shows proteins composed of two functional domains. 

The N-terminal part is responsible for the ca - 

talytic activity, while the C-terminus is responsible 

for glucose-mediated inhibiting activity or other re - 

gulatory features. Digestion of this enzyme releases 

a 30 kDa fragment with some specific activity. Interestingly, 

this fragment does not lose its activity on 

freezing, unlike the integral protein [7]. 

The AC enzymatic activity has a broad range. 

The phosphorylated form of III Glc enzyme (a “phosphocarrier” 

protein) acts as a stimulating factor. One 

explanation might be that phosphorylated III Glc enzyme 

(the dephosphorylated form is inactive) phosphorylate, 

in turn, an amino acid (probably histidine 

or cysteine) from the AC regulator domain, thereby 

stopping inhibition [11]. In the absence of glucose, 

AC is fully phosphorylated and has high activity. 

Comparing different ACs from this class allo - 

wed the identification of two conserved histidine and 

one of them is presumably phosphorylated. The 

presence of a 95 kDa phosphorylated Escherichia 

coli protein was not detected. 

A RAS-like protein (cyclase activator from Saccharomyces 

cerevisiae) exists in Escherichia coli. 

Elongation factor Tu, a protein that binds GTP, activates 

the Escherichia coli AC, but their interaction 

mechanism is not known. This suggests that, as with 

most eukaryotes, enterobacteria cyclases seem to be 

regulated by G proteins [12]. 

In Enterobacteriaceae, all the major features of 

the Escherichia coli cya gene (such as number of 

promoters and genes upstream and downstream) are 

preserved. Salmonella typhimurium AC, similar to 

Escherichia coli AC, is controlled by three promoters 

and is also repressed by cAMP receptor protein 

-cAMP complex [13]. Pasteurella multocida’s AC 

gene is very similar to that of enterobacteria, but the 

local organization of the genes is different. H. influnzae’s 

AC gene shows similarities with its counterpart 

in Escherichia coli. The data indicate that the activity 

regulating mechanism of the AC protein appears 

to be conserved in this class. Gene expression differs 

in Pasteurella, Haemophilus and Aeromonas species 

compared to the Enterobacteriaceae [1]. 

ADENYLATE CYCLASE OF PATHOGENIC 

BACTERIA (CLASS II ADENYLATE CYCLASES) 

Increased production of cAMP in the host cell, 

by toxins with AC activity, is a strategy adopted by 

many pathogenic bacteria. The enzyme enters into 

the target cells and, after its activation by specific 

factors (such as CaM), triggers the formation of intracellular 

cAMP. Four of these toxins have been 

identified and studied: Bordetella pertussis AC 

(CyaA), Bacillus anthracis edema factor (EF), 

Pseudomonas aeruginosa AC (ExoY) and Yersinia 

pestis AC. 

The main targets of these toxins are the effector 

cells of the immune system. Accumulation of cAMP 

in the cytoplasm disrupts cellular functions, affecting 

the immune system and facilitates the survival of 

bacteria in the body. This often represents a critical 

step in the pathogenesis of many infectious diseases. 

1. Bordetella pertussis Adenylate Cyclase 

Bordetella sp. are Gram-negative aerobic cocobacilli 

that cause respiratory tract infections in 

mammals. Bordetella pertussis produces a highly 

contagious disease known as whooping cough. This 

disease is initiated by bacterial adherence to respiratory 

epithelium and its colonization. 

Bordetella pertussis produces two toxins, 

namely the invasive AC (CyaA) and the pertussis 

64

Adenylate cyclases involvement in pathogenicity, a minireview 

toxin, both of which are essential for bacterial virulence. 

AC causes a rapid increase in cAMP intracellular 

levels, which is required to initiate colonization 

(within days of infection). By accumulation of cAMP 

in host cells, cellular functions and the mechanisms 

of defense are inhibited [14, 15]. Research has 

shown that partially purified CyaA may inhibit 

phagocytosis by altering chemotaxis and oxidative 

response by increasing intracellular cAMP. It also 

causes apoptosis in macrophages. Pertussis toxin 

acts later and amplifies the cAMP signal, thus playing 

an important role in the persistence of bacteria 

in the body [16]. 

AC was first described as an exotoxin in 1973 

[17]. The first attempts to purify it [18] were made 

three years later. Subsequently, in 1980, it was reported 

that CyaA is activated by CaM [19]. 

The protein is secreted by a mechanism specific 

for Gram-negative bacteria, which is similar to Escherichia 

coli hemolysin release [20]. Usually, secretion 

of Gram-negative bacteria proteins requires 

the presence of a signal peptide at their N-terminal 

end. The signal peptide determines protein translocation 

into bacteria periplasm. There, the peptide is 

cleaved and protein exported by a specific mechanism. 

It was observed that Bordetella pertussis AC 

does not have this signal peptide, which indicates 

that it is not secreted through the normal mechanism 

of secretion. Secretion of CyaA protein requires the 

presence of three genes (cyaB, cyaD and cyaE) located 

downstream from cyaA gene (the gene for 

AC). They are organized in one operon, under the 

control of cyaA promoter [16]. This is similar to Escherichia 

coli hemolysin, where the required genes 

are: hlyD, hlyB and hlyC, the latter being involved 

in activating the protein. The cyaC gene (counterpart 

of Escherichia coli hlyC gene) is located upstream 

from the cyaA gene. The order of genes in the Bordetella 

pertussis genome is: cyaC, cyaA, cyaB, cyaD 

and cyaE [1]. The cyaA gene transcription, as well 

as that of the other genes involved in virulence, is 

regulated by signals from the environment. 

Cloning of Bordetella pertussis AC has played 

an important role in analyzing the structure and function 

of this protein. The first AC purified and biochemically 

studied was the AC from Bordetella 

per tussis expressed in Escherichia coli. Despite numerous 

attempts, the Bordetella pertussis cyaA gene 

was cloned only in 1988 [21]. 

Synthesized as an inactive protein, Bordetella 

pertussis AC is activated by palmitoylation of two 

lysine residues located at positions 860 and 983 [22]. 

This is a CyaC - dependent process [20]. 

Bordetella pertussis AC is a 1706 amino acids 

protein and has a modular structure with two functional 

domains. The first ~400 amino acids (the N- 

terminal end of the protein) comprise the CaM 

dependent catalytic domain. The remaining 1306 

amino acids (located in the C-terminal region) form 

a hemolysin which mediates the binding and internalization 

of the catalytic domain into eukaryotic 

cells. Both domains can function independently of 

each other [23]. 

The complete protein has a molecular mass of 

200 kDa. Protein digestion with trypsin releases a 

fragment of 43 kDa (the catalytic domain), with an 

enzymatic activity similar to that of the whole protein. 

[24]. 

CyaA can interact with different cell types, but 

the immune effector cells are the main target. Internalization 

of bacteria is not necessary to induce cytotoxicity. 

The catalytic domain is introduced in the 

host cell cytosol, where it is activated by CaM and 

produces large quantities of intracellular cAMP. The 

catalytic domain is translocated through the membrane 

directly into the target cell cytosol by a process 

called internalization. There is some evidence concerning 

the mechanism of translocation. A rise in intracellular 

cAMP can be detected few seconds after 

addition of CyaA toxin. The endocytosis requires a 

longer time and is pH dependent. And last but not 

least, CyaA can invade cells that have a low membrane 

transport, such as mammalian erythrocytes [20]. 

Recently, a model for the mechanism of AC internalization 

into cells was proposed. It involves two 

distinct conformers that employ the same segment 

of the hydrophobic subdomain of the hemolytic AC 

domain. One conformer forms oligomeric cation-selective 

pores that determine potassium efflux from 

phagocytes. The other conformer remains as a mo - 

no mer and is responsible for AC translocation into 

the cell [25, 26, 27]. The catalytic domain is unfol - 

ded and translocated through the membrane. This 

process of internalization of the toxin is calcium dependent. 

Ca 2+ binding determines conformational 

chan ges of the protein, from globular form to elongated 

form. Translocation of the AC domain into 

host cell allows Ca 2+ influx through a novel type of 

calcium path in the target membrane [28]. The region 

375-385 is crucial for membrane insertion and 

translocation of Bordetella pertussis AC [29]. 

The Catalytic Domain of Bordetella pertussis 

Adenylate Cyclase 

Once in the cell, in order to catalyze cAMP synthesis, 

the AC is activated by the C-terminal lobe of 

CaM [19] (Fig. 1) through conformational drift of the 

65


catalytic domain. Experiments have shown that the 

enzyme remains membrane associated, with ATP and 

CaM -binding domains exposed to the cytoplasm. 

The ATP binding site, 54 GVATKGLGVHAKSS- 

DWG 70 , is represented by the sequence of the amino 

acids 54-70. Fluorescence studies have shown that 

AC forms a complex with CaM, tightly bound by 

several contact points. The Bordetella pertussis AC 

binds CaM with high affinity, increasing its enzymatic 

activity over 1000-fold. Ca 2+ ions, bound to 

CaM, contribute to the stabilization of the AC-CaM 

complex [30]. 

The catalytic domain is comprised in two regions: 

T25 and T18 (obtained in vitro by limited proteolysis). 

The catalytic site is in T25 (amino acids 

1-224), while T18 (amino acids 225-399) contains 

the CaM-binding domain [20]. The 224 amino acids 

N-terminal fragment of the Bordetella pertussis AC 

catalytic domain shows only 0.1% of the native enzyme 

activity. It seems that this fragment is particularly 

important in the structure of the catalytic active 

center, but it cannot be fully active in the absence of 

the 225-399 fragment (which acts as an activator of 

the first), the N 304 residue of CyaA being involved 

in catalysis [31]. Residues 196-267 (partially overlapping 

sequence over the two regions) play an important 

role in binding CaM. The regions of contact 

between CyaA and CaM include four AC segments: 

H 197 –R 206 , R 235 –R 246 , R 250 –R 259 and E 346 –R 360 . Directed 

mutagenesis and crystallization studies have 

demonstrated that W 242 is the key binding residue. 

It interacts with the C-terminal segment of CaM, 

being surrounded into a hydrophobic pocket by I 125 , 

F 141 and four Methionine residues (M 169 , M 124 , M 144 

and M 145 ) [31]. Another important role in CaM binding 

is played by residues R 258 , R 259 and E 356 [32]. 

Full enzymatic activity can be restored if the 

two fragments (T25 and T18) are reunited in the 

presence of CaM or fused to peptides or proteins that 

are able to interact [33]. 

CaM-binding domain of myosin kinase from 

chicken smooth muscle ( 494 RRKWQKTGHA - 

VRAIG 505 ) has a similar sequence with a protein 

fragment located in the N-terminal half of Bordetella 

pertussis AC catalytic domain ( 164 RRKGGDDFEA - 

VKVIG 178 ). Replacing the first three amino acids 

(RRK) with glutamic acid residues reduces the AC 

affinity for CaM. Stabilization of the AC-CaM complex 

is done by the interaction between the CaM 

negatively charged amino acids and the AC basic 

ones (such as fragment RRK) [1]. CaM is necessary 

both for nucleotide binding to the catalytic active 

center and for initiating the catalytic activity. 

There are four amino acids essential in ATP 

binding and enzymatic activity. They are: K 58 and 

K 65 , present in G - - - - GK (T / S) sequence and D 188 

and D 190 , present in 184 PLTADID 190 region. All four 

interact with Mg 2+ -ATP (at α and β phosphate 

moieties) [1]. 

AC enzymatic activity is dependent on divalent 

cations, but is not affected by α-ketoacids or guanine. 

Various amphiphilic substances, such as phosphatidyl-choline, 

phosphatidyl-ethanolamine and 

phosphatidyl-serine, were found to have a stimula - 

ting effect on enzymatic activity. [34]. 

Hemolysin Domain of the Bordetella pertussis 


At the C-terminus of the protein, after the ca - 

talytic sequence, there is a 1300 amino acids domain 

highly similar to the Escherichia coli α-hemolysin. 

The C-terminal domain of Bordetella pertussis AC 

(represented by amino acids 400-1706) has a Ca 2+ - 

dependent hemolytic activity. This hemolytic domain 

forms cation-selective channels in target cells 

membrane to insert the AC catalytic domain into the 

eukaryotic cytoplasm. It is divided into three subdomains. 

The pore-forming region, located at amino 

acids 500-700, is rich in hydrophobic amino acids, 

forming four potential transmembrane spans [35]. 

The second subdomain, between amino acids 700- 

1000, is a fatty acylation domain highly similar with 

internal domain of Escherichia coli α-hemolysin, 

where the posttranslational activation by palmitoylation 

of K 983 and K 860 is taking place [22]. Both of 

these subdomains are required for channel formation 

in lipid bilayer membranes [36]. The third subdomain, 

between amino acids 1006-1638, contains 

glycine- and aspartate-rich nonapeptide repeats, 

characteristic of RTX proteins, involved in binding 

of Ca 2+ and the interaction with the host cell membrane 

[37, 38]. 

2. Bacillus anthracis Adenylate Cyclase 

Anthrax is a disease that affects mainly animals, 

but may spread to humans through contact with infected 

animals or contaminated animal products. It 

is caused by aerobic spores of a Gram-positive bacterium, 

called Bacillus anthracis. The disease is initiated 

by spores entering the body. 

The anthrax toxic complex has a binary character, 

expressing its components independently. Enzymatic 

component (lethal factor - LF and edema fac tor - EF 

proteins) acts on the substrate located in the cytosol, 

while the binding component protective antigen (PA) 

is a multifunctional protein that binds to receptors 

on the surface of target cells. After bin d ing, it is 

cleaved by other surface proteins (such as Furin), 

66


with the release of a 20 kDa fragment from the 

N-terminus. The remaining fragment of 63 kDa (also 

called PA 63 ) is then subjected to oligomerization and 

form a heptamer ring which binds up to three molecules 

of EF, LF or both, by competitive binding [39]. 

The complex formed undergoes receptor-mediated 

endocytosis. Later, conformational chan ges, due to 

increased acidity, lead to the insertion of the heptamer 

in the endozomal membrane and subsequent 

translocation of LF and EF into the cytosol. Here 

they exert their toxic effect against the host cell. 

Deletion of PA abolishes the Bacillus anthracis virulence 

[40]. 

Separately, the three proteins PA, LF, EF are not 

toxic. Combination of PA and LF, called lethal toxin, 

results in death of laboratory animals, while combination 

of PA and EF, called edema toxin, induces increased 

intracellular levels of cAMP and produce 

edema [41]. 

LF is a zinc dependent metalloproteinase that 

cleaves certain MAP kinase isoforms from macro - 

phages, leading to death and inhibition of cell proliferation. 

EF is a Ca 2+ -CaM - dependent AC, which 

produces high intracellular cAMP levels by interfering 

with cell signaling [42, 43]. EF alone is not toxic, 

but is necessary to the survival of germinated spores 

in the early stages of infection [40]. 

After EF is translocated into the cytosol, it triggers 

an increased influx of Ca 2+ . Absence of Ca 2+ or 

presence of Ca 2+ channels antagonists in the extracellular 

environment prevents the accumulation of 

intracellular cAMP [16, 44]. Once arrived into the 

cytoplasm, EF is activated by CaM and catalyzes the 

synthesis of cAMP from ATP. 

The genes responsible for virulence are located 

on two plasmids: pXO1 plasmid (182 kb) and pXO2 

plasmid (95 kb). The pXO1 plasmid contains pagA, 

lef and cya genes, which encode components of the 

anthrax toxic complex, namely PA, LF and EF [42, 

43]. The expression of the three genes is regulated 

on transcriptional level through the carbonate / bicarbonate 

buffer system and temperature [16]. The 

pXO2 plasmid contains genes capA, capB and capC, 

required for capsule formation. 

The cya gene encodes an 800 amino acids protein 

with a signal sequence of 33 amino acids, located 

at N-terminal, which is removed after 

secretion. X-ray crystallography studies, performed 

in the presence and absence of CaM, have determined 

the structure of EF. This protein has two functional 

domains. The N-terminal 30kDa domain is 

similar with the LF terminal fragment domain and 

binds PA. The residues 1-28 of EF have a high proportion 

of highly charged residues. Residues 

136VYYEIGK 142 of EF (identical to the LF sequence 

147VYYEIGK 152 ) are involved in PA binding. Replacing 

residues Y 137 , Y 138 , I 140 and K 142 with A 

abolishes the ability of EF to bind to PA. The 58kDa 

EF catalytic domain is situated immediately after the 

PA binding domain, within 262-767 residues. It is 

dependent of CaM (Fig. 1). No activity can be detected 

in its absence, Ca 2+ -CaM complex being a 

more potent activator of EF than CaM alone [45]. 

The Catalytic Domain of Bacillus anthracis 


The catalytic domain consists of two subdomains: 

the N-terminal region, which contains the ca - 

talytic center and the C-terminal region, which binds 

CaM. 

Bacillus antracis AC activity is dependent of 

CaM and divalent ions such as Mg 2+ and Ca 2+ . Ca 2+ 

ions are needed to form Ca 2+ -CaM complex with 

high affinity for the enzyme (the complex having a 

stronger activator effect than CaM alone [45]). Mg 2+ 

and ATP forms Mg 2+ -ATP complex that acts as substrate. 

Ca 2+ can replace Mg 2+ to form a complex with 

ATP, with an affinity for the active site five times 

greater. Ca 2+ -ATP complex reduces the enzymatic reaction 

rate 250 times. The catalytic domain of EF 

has three globular domains [46, 47]. Studies on AC 

secondary structure showed that it has 34% β structure, 

16% α-helix structure and 14% “β-turn” structures 

[48]. The pI value of the protein without the 

N-terminal 261 amino acids, responsible for its interaction 

with PA, increases above 8, compared to 

the native protein whose pI is 6.45 [1]. 

NMR spectroscopy, secondary structure prediction 

and circular dichroism studies suggest that the 

segment located between amino acids 548 and 564 

of the Bacillus anthracis AC could be involved in 

CaM binding. By using a synthetic peptide, it has 

been observed that the sequence located between 

522-565 shows a high affinity for CaM. This segment, 

like other peptides known to bind CaM, shows 

mostly basic and hydrophobic amino acids, separated 

by an α-helix structure [49]. Four regions of 

EF are involved in CaM binding (516-540, 615-634, 

647-672 and 695-721), residue K 525 being the key 

binding residue [46]. The amino acids segment 579- 

590 forms a catalytic loop stabilized upon CaM 

binding [46, 50]. 

After binding of CaM conformational changes 

occur that lead to the formation of a binding site with 

high affinity for ATP. This site, identified by directed 

mutagenesis, is 314 GxxxxGKS 321 (a consensus sequence). 

By replacing K 320 with N, the AC catalytic 

67


activity decreases 10 times compared to the native 

protein. The EF crystal structure suggests that H 351 

(H 318 , if we take into account the protein without signal 

sequence) has an important role in catalysis [46]. 

However the mutational and crystallographic results 

show that H 351 does not serve as a catalytic base. It 

may be responsible for deprotonation of the ATP 

3’OH group [50]. R 329 , K 346 , K 352 , and K 372 are involved 

in the tight binding of ATP to the active site 

[48, 50]. The conserved aspartates D 491 and D 493 

have an important contribution in the AC activity by 

binding two metal ions that stabilize the reaction intermediate 

[50]. EF has a high catalytic activity with 

a V max of 1.2 mmol cAMP/min/mg protein. Its optimal 

catalytic activity is at 0.2 mM Ca 2+ . The enzy - 

ma tic activity is inhibited by higher calcium 

con cen trations [45]. 

3. Adenylate Cyclase of Pseudomonas aeruginosa 

(ExoY) 

Three species of Pseudomonas genus are known 

to cause infections in humans. Pseudomonas mallei 

is a nonmotile species that causes glanders in horses. 

It can also infect humans. Pseudomonas pseudomallei 

causes melioidosis, a tropical disease that affects 

both humans and animals. Pseudomonas aeruginosa, 

a Gram-negative aerobic bacterium, is found 

predominantly in soil and water. It is a common 

pathogen for plants and animals. It is an opportunistic 

pathogen that causes infections of the urinary 

tract and respiratory system, dermatitis, soft tissue 

infections, bacteremia and a variety of systemic infections, 

especially in people with severe burns, cancer 

or AIDS, usually in immunosuppressed persons. 

Pseudomonas aeruginosa infection has three stages: 

attachment and colonization, local invasion and dissemination 

in the body [16]. 

Various determinants such as certain proteases, 

alginate, phospholipases and toxins are involved in 

Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. An important 

determinant of virulence is ExoS regulon, whose 

expression is correlated with dissemination of bacteria, 

from the colonization site, into the vascular 

system. ExoS regulon comprises a set of virulence 

genes, regulated in a coordinated manner at the transcriptional 

level by ExsA (a regulatory protein from 

AraC family). It regulates its own synthesis, as well 

as some operons which encode proteins involved in 

eukaryotic cell cytotoxicity, a process achieved 

through type III secretion. Three classes of proteins 

are involved: components of the secretion apparatus, 

effectors that mediate protein translocation into the 

host cell and effector proteins that disrupt normal 

cellular processes [16]. Effectors translocation leads 

to inhibition of phagocytosis, allowing the bacteria 

to multiply and damage the epithelium. Four effector 

proteins have been identified: ExoS – a bifunctional 

protein with N-terminal GTPase activating protein 

(GAP) and ADP-ribosyltransferase activities, ExoU 

– with a phospholipase A2 activity causing acute cytotoxicity, 

ExoT – a bifunctional protein closely related 

to ExoS and ExoY - an AC [51, 52]. Almost no 

strain encodes both ExoU and ExoS, while ExoT and 

ExoY are encoded by almost all strains. All four effectors 

require a host cofactor for their activities [52] 

Infection of eukaryotic cells with strains of 

Pseudomonas aeruginosa expressing AC (ExoY) 

leads to increases in intracellular cAMP levels, as 

well as morphological changes of the cell such as cytoskeleton 

disruption and cell rounding and temporarily 

inhibits the internalization of Pseudomonas 

aeruginosa in the epithelial cells [53]. These effects 

cannot be observed when the type III secretion apparatus 

is inactivated (by mutations or deletions) or 

there is an inactive form of ExoY and simply adding 

ExoY does not increase the level of cAMP. This suggests 

that ExoY is introduced into the cell through a 

mechanism of type III translocation system (also 

called polarized translocation) [16, 54]. 

ExoY is a 42 kDa protein encoded by a gene of 

1134 bp. It is a thermolabile protein. Residues 41- 

107 and 209-221 of ExoY show homology with sequences 

of Bacillus anthracis EF and of Bordetella 

pertussis invasive AC. The first conserved region 

(41-107 fragment) contains ATP / GTP, binding sites 

(it binds the α-phosphate moiety). The second conserved 

region (located at 209-221) binds the β and 

γ-phosphate moieties of ATP and shows homology 

with several proteins that bind nucleotides, including 

pyruvate kinase and phosphofructokinase [16]. 

ExoY sequence does not contain any similarities 

with the Bordetella pertussis or Bacillus anthracis 

ACs CaM-binding domains. Another distinctive feature 

is that ExoY has five cysteines. Enzyme activity 

is stimulated by an eukaryotic protein, different from 

CaM, which has not yet been identified [54]. The 

amino acids K 81 , K 88 , D 212 and D 214 , essential for 

ExoY enzymatic activity, were identified by directed 

mutagenesis [16]. 

4. Adenylate Cyclase from Yersinia pestis 

Genus Yersinia is composed of eleven species. 

Three of them, Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica 

and Yersinia pseudotuberculosis, are pathogenic 

to humans. They cause a wide spectrum of illnesses, 

from pulmonary plague to acute gastroenteritis. 

Yersinia pestis, a Gram-negative, facultative anaerobe 

bacterium, is a pleomorphic bacillus and does 

68


not ferment lactose. This aerobic bacillus, facultative 

anaerobic, produces plague. It is a pathogen that 

mainly affects rodents. Humans get plague bacte rium, 

accidentally via fleas or by handling an infected animal. 

In humans, the majority of bacterial cells is 

phagocytated and killed by polymorphonuclear leukocytes 

(PMN). Few bacilli are internalized and survive 

in macrophages to synthesize virulence factors. By 

breaking the cell, they are released into the extracellular 

environment, triggering systemic infection. Lung 

infections have a very high mortality [16]. 

There are three types of AC in Yersinia pestis: 

membrane-bound, cytoplasmic and extracellular. Extracellular 

AC is a 30kDa protein. Little is known 

about the role of this AC, but studies have shown that 

the protein suppresses the oxidative metabolism of 

peritoneal leukocytes in white mice [55]. Therefore 

it is supposed to be an important virulence factor. 

CLASS III ADENYLATE CYCLASES 

Class III ACs are found in prokaryotes and eukaryotes. 

Activation of these ACs is initiated by 

binding of stimulus to receptors on the cell surface. 

Based on the catalytic domains, four subgroups 

of class III ACs (a-d) have been proposed. The subclass 

IIIa ACs have the (F/Y)XX(F/Y)D motif at the 

dimer interface and EKIK motif. The subclass IIIb 

is characteristic for pseudo dimer bacteria and soluble 

mammalian ACs, that are activated by bicarbonate. 

The subclass IIIc corresponds to homodimer 

Gram-positive and Gram-negative bacteria ACs. The 

subclass IIId is represented by protozoan, trypanosomatids 

and fungi ACs, which have YEVKY [56, 57]. 

Ten different mammalian AC isoforms have been 

identified and cloned: nine membrane-associated 

(subclass IIIa) and one soluble isoform (subclass IIIb), 

coming from different sources (Table 1) [58]. 

Although genes coding for class III ACs are not 

organized into clusters and are dispersed over several 

chromosomes, the enzymes show a similar topology. 

They function as dimmers: heterodimers (mammals), 

pseudo heterodimers (metazoa) or homodimer 

(protozoa). The catalysis takes place at the interface 

of the dimmers [56]. The membrane-bound mammalian 

AC has two domains with six transmembrane 

spans and several potential phosphorylation sites, 

which could be involved in regulation. AC from 

bovine brain shares also this structure. The active 

catalytic core of the AC enzyme is formed by two 

protein fragments: one of 350 amino acids located 

between the first and second transmembrane region 

and one fragment of 300 amino acids located in the 

C-terminal end of the protein [1]. 

Despite increased expression, the two halves of 

the AC from bovine brain (each containing one 

transmembrane domain and one cytoplasmic do- 

Table 1. The mammalian adenylate cyclase isoforms 

Properties 

Ca 2 + -calmodulin 

complex sensitive 

types 

Stimulated by 

G subunit of G 

protein 

Inhibited by Ca 2+ 

and G subunit 

of G protein 

Not influenced 

by forskolin 

Soluble 

Adenylate cyclase 

isoforms 

Type I 

Type III 

Type VIII 

Type II 

Type IV 

Type VII 

Type V 

Type VI (considered 

as a subfamily of type 

V adenylate cyclases) 

Type IX (the most 

divergent family 

of membrane-bound 

adenylate cyclases) 

Soluble adenylate 

cyclase 

Source 

Brain and adrenal medulla 

Brain and olfactory epithelium 

Brain, lung, testis, adrenal gland, uterus, heart 

Brain, skeletal muscle, lung and heart 

Brain, kidney, liver, lung, brown adipose tissue, 

uterus 

Ubiquitous (highly expressed in the brain) 

Heart, brain, kidney, liver, uterus, adrenal gland, 

brown adipose tissue 

Ubiquitous 

Brain and muscle tissue 

Testis 

69


main) show enzyme activities less than 1% compared 

with the whole protein. But, as in the case of 

Bordetella pertussis AC, its activity increases significantly 

after co-expression of both domains [59]. 

The first mammalian AC was cloned from 

bovine brain. It was expressed in Sf9 cells, into a 

baculovirus vector. This enzyme can be activated by 

CaM, forskolin and Gαs (G protein α subunit which 

stimulates AC). Recombinant enzyme is inhibited by 

β and γ subunits of G protein. Other mammalian ACs 

were cloned using probes derived from the bovine 

sequence [60]. 

There are eight amino acids very important for 

catalysis in the class III AC: two aspartate residues 

that coordinate two metal cofactors (Mg 2+ or Mn 2+ ), 

a lysine and aspartate pair involved in selective bin - 

ding of the substrate, an arginine and asparagine pair 

which stabilizes the transition state and an arginine 

and lysine pair involved in positioning the pyrophosphate 

group [56, 61]. 

All types of membrane-bound mammalian ACs 

are stimulated by G sα -GTP. Other stimulatory effectors 

are: forskolin (types I-VIII), G βϒ (types II, IV 

and VII), protein kinase C (types I, II, III, V and VII). 

Type I, III and VII ACs are the only mammalian AC 

that interact with CaM, as seen in Fig. 1. AC-inhi - 

bitory properties have: protein kinase A, G iα -GTP and 

Ca 2+ (types V and VI), G βϒ (types I, III and VIII), protein 

kinase C (types IV and VI). Soluble AC is the 

most divergent of mammalian ACs and similar to 

that found in cyanobacteria. It is activated by bicarbonate 

and Ca 2+ [1, 56, 57, 61]. 

Ca 2+ -CaM complex is a potent stimulator of 

type I and VIII ACs activity. There are two CaMbinding 

domains in the structure of type I AC: one 

located between amino acids 495-522 and the other 

between amino acids 1027-1050. Both are rich in 

basic amino acids. The fluorescence analysis showed 

that the most plausible CaM-binding domain is the 

sequence situated between residues 495 and 522. 

The affinity of this peptide to CaM is seven times 

higher than that of the whole protein [59]. On the 

other hand, the CaM binding site of other types of 

ACs differs from this one: a site is located in the 

N-terminal region and the other in the C-terminal region. 

Studies have shown that the C-terminal region 

is sufficient for in vitro activation of the enzyme, but 

in vivo are needed both C- and N-terminal region. 

Ca 2+ -CaM complex (activated by G protein α 

subunit or by forskolin) can also act as a secondary 

activator of type III AC activity [57]. 

A COMPARISON OF ADENYLATE CYCLA SES: 

SIMILARITIES AND DIFFERENCES 

Distribution of genetic information for AC in 

different sources is distinct. Thus, the gene for the 

Bordetella pertussis AC (cyaA) is located in an 

operon (under the control of cyaA promoter), the 

Bacillus. anthracis cya gene is located in one of the 

two virulence plasmid, namely pXO1 and the gene 

for Pseudomonas aeruginosa ExoY belongs to ExoS 

regulon, which is regulated by ExsA protein [16, 42, 

43]. Genes for different types of class III ACs are organized 

on many chromosomes. This shows that the 

expression of these enzymes may be regulated differently 

depending on environmental conditions. 

The structure of these proteins varies, depen - 

ding on their function and the organism from which 

they arise. CyaA and Escherichia coli AC have a 

modular configuration, which consists of two functional 

domains: one catalytic and one hemolytic for 

CyaA or regulator for Escherichia coli Cya [23]. 

Bacillus anthracis EF belongs to the toxic complex. 

In order to exercise their function in the host cell it 

must first interact with PA. Bacillus anthracis enzyme’s 

catalytic domain is located in the C-terminal 

part of the protein, while the N-terminal part comprises 

the PA binding [39]. The catalytic domain of 

other pathogenic bacteria enzymes is located in the 

N-terminal end (e.g. CyaA, ExoY). For the class III 

ACs, the situation is different because they function 

as dimers, with the catalytic site at the interface of 

the dimers [56]. The class III membrane-bound 

mammalian ACs have two similar areas (each one 

has a cytoplasmic subdomain and a transmembrane 

subdomain, consisting of six hydrophobic regions) 

that cannot operate independently [1]. 

Fig. 1 - Enzyme activation by Calmodulin-Calcium complex 

70


These pathogenic bacteria AC have three highly 

homologous regions, but the mechanisms of secretion 

and entry in eukaryotic cell is different. Internalization 

of toxins by eukaryotic host cells is 

achieved through the hemolytic domain (which creates 

pores in the membrane) for Bordetella pertussis 

AC; by endocytosis for Bacillus anthracis AC [16, 

25, 26, 27, 39]. For both ACs, internalization of the 

catalytic domain triggers an increased influx of Ca 2+ 

into the host cell [16, 28, 44]. These ACs are activated 

by CaM [19, 42]. Another virulence factor 

found in Pseudomonas aeruginosa, an AC protein 

called ExoY, is inserted into the host cell via a type 

III mechanism and activated by an eukaryotic factor, 

other than CaM [16, 54]. 

After entering the cytoplasm, the enzyme interacts 

with CaM (or other activator), causing intense 

cAMP synthesis and disruption of cell functions [14, 

15, 41, 53]. Class II ACs (eg. Bordetella pertussis 

CyaA toxin, Bacillus anthracis edema factor) have 

some special features, most important of which is 

the activation by CaM, protein absent in bacteria [19, 

42, 43]. Dependence of bacterial ACs on CaM is an 

important aspect. CaM is not synthesized by bacteria 

and a constitutive AC activity would be lethal. 

Although at first glance, these cyclases similar 

functions (in particular those of Bordetella pertussis 

and Bacillus anthracis) suggest a similar structure, 

the primary structure shows important differences in 

terms of size and a relatively low sequence similarity. 

Location of the ATP binding sites and activation 

mechanism of Bordetella pertussis and Bacillus anthracis 

ACs are similar. Following our sequence 

analysis of pathogenic bacteria AC catalytic domains 

– in particular Bacillus anthracis CyaA (residues 

224-506), Pseudomonas aeruginosa ExoY (residues 

1-255) and Bordetella pertussis CyaA (residues 1- 

231) - we presume that the ATP binding site of 

Pseudomonas aeruginosa could be 80 TKGFSVK - 

GKSS 90 (see box in alignment in Fig. 2). In addition 

to protein sequence, three-dimensional structure 

analysis of these fragments (Fig. 3) has helped us to 

propose a possible secondary structure for this ExoY 

fragment, as evidenced in Fig. 2. 

ACs are widespread enzymes, being present 

both in prokaryotes and eukaryotes. Although they 

have the same enzymatic activity (ATP cyclization), 

the structure of these proteins varies, depending on 

their function and the producing organism. The sequence 

analysis of catalytic domain of AC from bacterial 

species with known three-dimensional 

struc tures could make possible the prediction of the 

ATP binding site structure of ACs produced by other 

bacterial strains. 

Fig. 2 - Sequence alignment: Bacillus anthracis CyaA (residues 224-506), 

Pseudomonas aeruginosa ExoY (residues 1-255) and Bordetella pertussis CyaA (residues 1-231) 

and the proposed secondary structure of the catalytic ExoY domain (see box in alignment) 

71


Fig. 3 - Three-dimensional structure analysis of AC fragments: 

A. Bacillus. anthracis CyaA (residues 224-506); B. Bordetella pertussis CyaA (residues 1-231) and 

C. Bacillus anthracis CyaA (residues 224-506) superimposed over Bordetella pertussis CyaA (residues 1-231). 

REFERENCES 

1. Barzu O. and Danchin A. Adenylyl Cyclases: A He - 

terogeneous Class of ATP-Utilizing Enzymes. Prog 

Nucleic Acid Res Mol Biol. 1994. 49:241-83. 

2. Baker DA, Kelly JM. Structure, function and evolution 

of microbial adenylyl and guanylyl cyclases. Mol Microbiol 

2004. 52(5):1229-42. 

3. Sismeiro O, Trotot P, Biville F, Vivares C, Danchin A., 

Aeromonas hydrophila adenylyl cyclase 2: a new class 

of adenylyl cyclases with thermophilic properties and 

sequence similarities to proteins from hyperthermophilic 

archaebacteria., J Bacteriol. 1998 Jul; 

180(13):3339-44. 

4. Smith N, Kim SK, Reddy PT, Gallagher DT., Crystallization 

of the class IV adenylyl cyclase from Yersinia 

pestis., Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 

2006 Mar 1;62(Pt 3):200-4. Epub 2006 Feb 10. 

5. Cotta MA, Whitehead TR & Wheeler MB (1998) Identification 

of a novel adenylate cyclase in the ruminal 

anaerobe, Prevotella ruminicola D31d. FEMS Microbiol 

Lett 164, 257–260. 

6. Tellez-Sosa J, Soberon N, Vega-Segura A, Torres-Marquez 

ME, Cevallos MA., The Rhizobium etli cyaC 

product: characterization of a novel adenylate cyclase 

class., J Bacteriol. 2002 Jul; 184(13):3560-8. 

7. Roy, A., P. Glaser, and A. Danchin. Aspects of the regu - 

lation of adenylate cyclase synthesis by Escherichia 

coli K-12. J. Gen. Microbiol. 1988. 134(2):359-67. 

8. Jovanovitch, S. B. Regulation of cya-lac fusions by 

cyclic AMP in Salmonella typhimurium. J Bacteriol. 

1985. 161(2):641-9. 

9. Mori, K., and H. Aiba. Evidence for negative control 

of cya transcription by cAMP and cAMP receptor protein 

in intact Escherichia coli cells. J Biol Chem. 1985. 

260(27):14838-43. 

10. Reddy, P. S., A. Peterkofsky, and K. McKenney. 

Transla tional efficiency of the E. coli adenylate cyclase 

gene: mutating the UUG initiation codon to 

GUG or AUG results in increased gene expression. 

Proc Natl Acad Sci U S A. 1985. 82(17):5656-60. 

11. Levy S., Zeng G.Q., and Danchin A. Cyclic AMP synthesis 

in Escherichia coli strains bearing known deletions 

in the pts phosphotransferase operon. Gene. 

1990. 86(1):27-33. 

12. Reddy P., Miller D. and Peterkofsky A., Stimulation of 

Escherichia coli adenylate cyclase activity by elongation 

factor Tu, a GTP-binding protein essential for protein 

synthesis. J Biol Chem. 1986 261(25):11448-51. 

13. Thorner, L. K., J. P. Fandl, and S. W. Artz. Analysis 

of sequence elements important for expression and 

regulation of the adenylate cyclase gene (cya) of Salmonella 

typhimurium. Genetics. 1990. 125(4):709-17. 

14. Confer DL, Eaton JW. (1982), Phagocyte impotence 

caused by an invasive bacterial adenylate cyclase., 

Science. 1982 Sep 3;217(4563):948-50. 

15. Hanski E., Invasive adenylate cyclase toxin of Bordetella 

pertussis, Trends Biochem Sci. 1989 Nov; 

14(11):459-63. 

16. Ahuja N, Kumar P, Bhatnagar R. The Adenylate Cyclase 

Toxins. Crit Rev Microbiol 2004. 30(3):187-196. 

17. Wolff J, Cook GH. Activation of thyroid membrane 

adenylate cyclase by purine nucleotides. J Biol Chem. 

1973, 248(1):350-5. 

18. Hewlett E, Wolff J. Soluble adenylate cyclase from the 

culture medium of Bordetella pertussis: purification and 

characterization. J Bacteriol. 1976, 127(2):890-8. 

19. Wolff J., Cook G. H., Goldhammer A. R., and Ber - 

kowitz S. A. Calmodulin activates prokaryotic adenylate 

cyclase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1980, 77(7): 

3841-844. 

20. Landant D., Ullmann A. Bordetella pertussis adenylate 

cyclase: a toxin with multiple talents. Trends Micobiol 

1999. 7(4): 172-6. 

72


21. Glaser P, Ladant D, Sezer O, Pichot F, Ullmann A, 

Danchin A. The calmodulin-sensitive adenylate cyclase 

of Bordetella pertussis: cloning and expression 

in Escherichia coli. Mol Microbiol 1988. 2(1):19-30. 

22. Masin J, Basler M, Knapp O, El-Azami-El-Idrissi M, 

Maier E, Konopasek I, Benz R, Leclerc C, Sebo P., 

Acylation of lysine 860 allows tight binding and cytotoxicity 

of Bordetella adenylate cyclase on CD11bexpressing 

cells., Biochemistry. 2005 Sep 27; 

44(38):12759-66. 

23. Sakamoto H, Bellalou J, Sebo P, Ladant D. Bordetella 

pertussis adenylate cyclase toxin. Structural and functional 

independence of the catalytic and hemolytic activities. 

J Biol Chem. 1992 267(19):13598-602. 

24. Bellalou J, Sakamoto H, Ladant D, Geoffroy C, Ullmann 

A. Deletions affecting hemolytic and toxin activities 

of Bordetella pertussis adenylate cyclase. 

Infect Immun. 1990, 58(10):3242-7. 

25. Vojtova-Vodolanova J, Basler M, Osicka R, Knapp O, 

Maier E, Cerny J, Benada O, Benz R, Sebo P., 

Oligomerization is involved in pore formation by Bordetella 

adenylate cyclase toxin., FASEB J. 2009 

Sep;23(9):2831-43. Epub 2009 May 5. 

26. Osickova A, Masin J, Fayolle C, Krusek J, Basler M, 

Pospisilova E, Leclerc C, Osicka R, Sebo P., Adenylate 

cyclase toxin translocates across target cell membrane 

without forming a pore., Mol Microbiol. 2010 

Mar;75(6):1550-62. Epub 2010 Feb 23. 

27. Fiser R, Masin J, Bumba L, Pospisilova E, Fayolle C, 

Basler M, Sadilkova L, Adkins I, Kamanova J, Cerny 

J, Konopasek I, Osicka R, Leclerc C, Sebo P., Calcium 

Influx Rescues Adenylate Cyclase-Hemolysin from 

Rapid Cell Membrane Removal and Enables Phagocyte 

Permeabilization by Toxin Pores, PLoS Pathog. 

2012 April; 8(4): e1002580. 

28. Fiser R, Masín J, Basler M, Krusek J, Spuláková V, 

Konopásek I, Sebo P., Third activity of Bordetella 

adenylate cyclase (AC) toxin-hemolysin. Membrane 

translocation of AC domain polypeptide promotes calcium 

influx into CD11b+ monocytes independently of 

the catalytic and hemolytic activities., J Biol Chem. 

2007 Feb 2; 282(5):2808-20. Epub 2006 Dec 4. 

29. Karst JC, Barker R, Devi U, Swann MJ, Davi M, 

Roser SJ, Ladant D, Chenal A., Identification of a region 

that assists membrane insertion and translocation 

of the catalytic domain of Bordetella pertussis CyaA 

toxin., J Biol Chem. 2012 Mar 16; 287(12):9200-12. 

Epub 2012 Jan 12. 

30. Selwa E, Laine E, Malliavin TE., Differential role of 

calmodulin and calcium ions in the stabilization of the 

catalytic domain of adenyl cyclase CyaA from Bordetella 

pertussis., Proteins. 2012 Apr; 80(4):1028-40. 

doi: 10.1002/prot.24005. Epub 2012 Jan 9. 

31. Guo Q, Shen Y, Lee YS, Gibbs CS, Mrksich M, Tang 

WJ. Structural basis for the interaction of Bordetella 

pertussis adenylyl cyclase toxin with calmodulin. 

EMBO J. 2005. 24(18):3190-201. 

32. Glaser P, Elmaoglou-Lazaridou A, Krin E, Ladant D, 

Bârzu O, Danchin A. Identification of residues essential 

for catalysis and binding of calmodulin in Bordetella 

pertussis adenylate cyclase by site-directed 

mutagenesis. EMBO J. 1989, 8(3):967-72. 

33. Dautin N., Karimova G., Ladant D. Bordetella pertussis 

adenylate cyclase toxin: a versatile screening tool. 

Toxicon 2002. 40: 1383–1387. 

34. Wolff J, Cook GH. Amphiphile-mediated activation 

of soluble adenylate cyclase of Bordetella pertussis. 

Arch Biochem Biophys. 1982 215(2):524-31. 

35. Osickova A, Osicka R, Maier E, Benz R, Sebo P., An 

amphipathic alpha-helix including glutamates 509 and 

516 is crucial for membrane translocation of adenylate 

cyclase toxin and modulates formation and cation selectivity 

of its membrane channels., J Biol Chem. 1999 

Dec 31;274(52):37644-50. 

36. Benz R, Maier E, Ladant D, Ullmann A, Sebo P 

(1994), Adenylate cyclase toxin (CyaA) of Bordetella 

pertussis. Evidence for the formation of small ion-permeable 

channels and comparison with HlyA of Escherichia 

coli., J Biol Chem. 1994 Nov 4; 

269(44):27231-9. 

37. Welch RA. Pore-forming cytolysins of gram-negative 

bacteria. Mol Microbiol. 1991 5(3):521-8. 

38. Rose T, Sebo P, Bellalou J, Ladant D., Interaction of 

calcium with Bordetella pertussis adenylate cyclase 

toxin. Characterization of multiple calcium-binding 

sites and calcium-induced conformational changes., J 

Biol Chem. 1995 Nov 3; 270(44):26370-6. 

39. Collier RJ., Membrane translocation by anthrax toxin., 

Mol Aspects Med. 2009 Dec; 30(6):413-22. Epub 

2009 Jun 27. 

40. Levy H, Weiss S, Altboum Z, Schlomovitz J, Rothschild 

N, Glinert I, Sittner A, Kobiler D., The effect 

of deletion of the edema factor on Bacillus anthracis 

pathogenicity in guinea pigs and rabbits., Microb 

Pathog. 2012 Jan; 52(1):55-60. Epub 2011 Oct 17. 

41. Stanley JL, Smith H. Purification of factor I and 

recognition of a third factor of the anthrax toxin. J Gen 

Microbiol. 1961 26:49-63. 

42. Robertson DL, Leppla SH. Molecular cloning and expression 

in Escherichia coli of the lethal factor gene 

of Bacillus anthracis. Gene. 1986 44(1):71-8. 

43. Robertson DL, Tippetts MT, Leppla SH. Nucleotide 

sequence of the Bacillus anthracis edema factor gene 

(cya): a calmodulin-dependent adenylate cyclase. 

Gene. 1988 73(2):363-71. 

44. Kumar P, Ahuja N, Bhatnagar R., Anthrax edema 

toxin requires influx of calcium for inducing cyclic 

AMP toxicity in target cells., Infect Immun. 2002 Sep; 

70(9):4997-5007 

45. Leppla SH. Bacillus anthracis calmodulin-dependent 

adenylate cyclase: chemical and enzymatic properties 

and interactions with eucaryotic cells. Adv Cyclic Nucleotide 

Protein Phosphorylation Res. 1984 17:189- 

98. 

46. Drum C. L., Yan S. Z., Bard J., Shen Y. Q., Lu D., Soelaiman 

S., Grabarek Z., Bohm A. and Tang W. J. Structural 

basis for the activation of anthrax adenylyl 

cy clase exotoxin by calmodulin. Nature 2002. 

415(6870):396-402. 

47. Liddington R. C. Anthrax: a molecular full nelson. 

Nature 2002. 415(6870):373-4. 

48. Labruyère E, Mock M, Surewicz WK, Mantsch HH, 

Rose T, Munier H, Sarfati RS, Bârzu O. Structural and 

ligand-binding properties of a truncated form of Bacil- 

73


lus anthracis adenylate cyclase and of a catalytically 

inactive variant in which glutamine substitutes for lysine-346. 

Biochemistry. 1991 30(10):2619-24. 

49. Munier H, Blanco FJ, Prêcheur B, Diesis E, Nieto JL, 

Craescu CT, Bârzu O. Characterization of a synthetic 

calmodulin-binding peptide derived from Bacillus anthracis 

adenylate cyclase. J Biol Chem. 1993 

268(3):1695-701. 

50. Shen Y, Zhukovskaya NL, Guo Q, Florian J, Tang 

WJ., Calcium-independent calmodulin binding and 

two-metal-ion catalytic mechanism of anthrax edema 

factor., EMBO J. 2005 Mar 9; 24(5):929-41. Epub 

2005 Feb 17. 

51. Frank DW. The exoenzyme S regulon of Pseudo - 

monas aeruginosa. Mol Microbiol. 1997 26(4):621-9. 

52. Engel J, Balachandran P., Role of Pseudomonas aeruginosa 

type III effectors in disease., Curr Opin Microbiol. 

2009 Feb; 12(1):61-6. Epub 2009 Jan 23. 

53. Cowell BA, Evans DJ, Fleiszig SM., Actin cytoskeleton 

disruption by ExoY and its effects on Pseudomo - 

nas aeruginosa invasion., FEMS Microbiol Lett. 2005 

Sep 1;250(1):71-6. 

54. Yahr TL, Vallis AJ, Hancock MK, Barbieri JT, Frank 

DW., ExoY, an adenylate cyclase secreted by the 

Pseudomonas aeruginosa type III system., Proc Natl 

Acad Sci U S A. 1998 Nov 10; 95(23):13899-904. 

55. Shevchenko LA, Mishankin BN. Adenylate cyclase 

of the causative agent of plague: its purification and 

pro perties. Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol. 

1987, 15-20. 

56. Linder JU, Schultz JE., The class III adenylyl cyclases: 

multi-purpose signalling modules., Cell Signal. 

2003 Dec; 15(12):1081-9. 

57. Krupinski J, Coussen F, Bakalyar HA, Tang WJ, Fein - 

stein PG, Orth K, Slaughter C, Reed RR, Gilman AG. 

Adenylyl cyclase amino acid sequence: possible channel- 

or transporter-like structure. Science 1989. 

244(4912):1558-64. 

58. Sunahara R. K. and Taussig R. Isoforms of Mammalian 

Adenylyl Cyclase: Multiplicities of Signaling. 

Mol Interv. 2002. 2(3):168-84. 

59. Tang WJ, Krupinski J, Gilman AG. Expression and cha - 

racterization of calmodulin-activated (type I) adenylylcyclase. 

J Biol Chem. 1991, 266(13):8595-603. 

60. Linder J. U.. Class III adenylyl cyclases: molecular 

mechanisms of catalysis and regulation. Cell Mol Life 

Sci. 2006. 63(15):1736-51. 

61. William F. Simonds, G protein regulation of adenylate 

cyclase, Trends Pharmacol Sci. 1999 Feb; 20(2):66-73. 

74

IMPLICAReA ADeNILAT CICLAZeLOR ÎN PATOGeNITATe, 

UN MINIReVIeW 

Adriana Costache*, Nadia Bucurenci, Adrian Onu 

Laboratorul de Enzimologie şi microbiologie aplicatã, institutul naþional de Cercetare – 

dezvoltare pentru microbiologie şi imunologie „Cantacuzino”, bucureşti, România 

ReZUMAT 

AMP ciclic (AMPc), unul dintre cei mai importanţi mesageri secundari, se formează prin ciclizarea 

ATP, catalizată de adenilat ciclază (AC). AC este o enzimă larg răspândită, fiind prezentă atât în 

eucariote, cât şi în procariote. Deşi au aceeaşi funcţie enzimatică (ciclizarea ATP), structura acestor 

proteine variază în funcţie de rolul lor metabolic şi de organismul din care provin. Unele bacterii 

patogene le utilizează ca toxine, care interacţionează cu calmodulina (sau alt activator eucariot), 

ducând la sinteza AMPc şi perturbarea funcţiilor celulare în celula infectată. Alte bacterii patogene 

utilizează creşterea activităţii AC în beneficiul metabolismului propriu. 

Am folosit analiza secvenţelor domeniilor catalitice ale adenilat ciclazelor a două bacterii patogene 

(Bacillus anthracis şi Bordetella pertussis) cu structuri tridimensionale cunoscute, pentru a 

evidenţia o structură secundară posibilă pentru aminoacizii 1-255 al AC din Pseudomonas aeruginosa 

(cu 80 TKGFSVKGKSS 90 ca situs de legare pentru ATP). 

Cuvinte cheie: adenilat ciclazã, calmodulinã, AMPc, toxinã 

INTRODUCERE 

Adenilat ciclazele (AC) (E.C.4.6.1.1) sunt enzimele 

care catalizează sinteza AMP ciclic (adenozin 

3’, 5’-monofosfat ciclic, AMPc), prin ciclizarea adenozin 

trifosfatului (ATP). 

AMPc este unul dintre cei mai importanţi mesageri 

secundari din celulele eucariote. Acest mesager 

este implicat în multe procese și funcţii celulare, 

ca metabolismul glucidelor şi al lipidelor. Reglarea 

concentraţiei sale intracelulare se realizează prin acţiunea 

adenilat ciclazei şi fosfodiesterazei. AC este 

utilizată de unele bacterii patogene ca exotoxină 

care, prin creşterea concentraţiei AMPc în celulele 

infectate, provoacă perturbări metabolice severe şi 

moarte celulară. Cel mai cunoscut exemplu este AC 

din Bacillus anthracis sau Bordetella pertussis care, 

translocată în celula eucariotă şi activată de calmodulină 

(CaM), generează AMPc. 

Pe de altă parte, în alte bacterii, AMPc este implicată 

în reglarea activării transcrierii, care are un 

rol important în adaptarea la mediu şi patogenitatea 

microorganismelor. 

AC au fost împărţite, în funcţie de secvenţa proteică, 

în trei clase principale [1]: 

l Clasa I (clasa Enterobacteria) include AC prezente 

în patogeni enterobacterieni ca Escherichia coli, 

Salmonella typhimurium şi Yersinia pestis şi în 

bacterii Gram negative (de ex. Vibrio cholerae şi 

Aeromonas hydrophila) [2]; 

l Clasa II include AC secretate de anumite bacterii 

(ex. Bacillus anthracis, Bordetella pertussis, Pseudomonas 

aeruginosa, Yersinia pestis), ca şi componente 

ale unor toxine; 

l Clasa III include AC prezente în numeroase organisme. 

Această clasă este cea mai mare şi include 

enzime care răspund la semnale extracelulare: hormoni, 

neurotransmiţători, chemochine etc. 

Pe măsură ce secvenţierea genomului a progresat, 

această clasificare a fost extinsă la şase clase: 

l Clasa IV include AC prezentă în Aeromonas hydrophila 

[3] şi Yersinia pestis [4]; 

l Clasa V include AC prezentă în Prevotella ruminicola 

(o bacterie anaerobă din rumen) [5]. 

l Clasa VI include AC prezentă în Rhizobium etli [6]. 

În această lucrare ne vom focaliza pe primele 

trei clase de AC. 

*autor corespondent: Adriana Costache, INCDMI Cantacuzino, Bucureşti, România, email: adriana_rad@yahoo.com 

75


ADENILAT CICLAZELE BACTERIILOR 

GRAM NEGATIVE (ADENILAT CICLAZELE DE 

CLASĂ I) 

Multe bacterii Gram negative sunt patogene (de 

ex. Enterobacteria), însă AC din această clasă nu 

sunt activate de factori celulari precum CaM. Ele au 

alţi activatori, având de cele mai multe ori roluri metabolice. 

De exemplu, pentru activarea completă a 

adenilat ciclazei Brevibacterium liquefaciens este 

necesar piruvatul, iar AC prezentă în Escherichia 

coli este inhibată de NaF, pirofosfat, anumiţi nucleozid-trifosfaţi 

şi de piridoxal-fosfat [7]. 

Cea mai studiată AC din această clasă este cea 

a Escherichiei coli, codificată de gena cya. Există 

trei promotori care îi controlează translaţia. Deşi cya 

este slab tradusă in vivo [7], activitatea promotorilor 

cya variază în funcţie de sursa de carbon din mediul 

extracelular şi scade foarte mult în prezenţa unor 

mari cantităţi de AMPc exogen [8]. AC este de asemenea 

inhibată în prezenţa complexului AMPc - receptori 

pentru AMPc, care se leagă la regiunea 

operator a promotorului cyaP2 [9]. Celulele exercită 

un control foarte strict al expresiei cya, o creştere de 

şase ori peste valoarea normală putând fi letală [10]. 

AC prezentă în Escherichia coli este o proteină 

de 848 aa, cu pI de 6,1. Este formată dintr-un domeniu 

de 395 de aminoacizi la capătul N-terminal, care 

conţine centrul catalitic activ şi un domeniu la capătul 

C-terminal, ce conţine domeniul reglator. De fapt, 

toate AC enterobacteriene sunt proteine alcătuite din 

două domenii funcţionale. Secvenţa N-terminală are 

activitate catalitică, în timp ce capătul C-terminal 

controlează inhibarea activităţii, mediată de glucoză, 

sau alte funcţii reglatoare. Digestia acestei enzime a 

permis izolarea unui fragment de 30 kDa care păstrează 

o parte din activitatea catalitică. Acest fragment, 

odată îngheţat, nu îşi pierde activitatea, spre 

deosebire de proteina integrală [7]. 

Activitatea enzimatică AC poate varia într-un 

interval larg. Forma fosforilată a enzimei III Glc (proteină 

“phosphocarrier” – proteină transportoare de 

grupări fosfat) acţionează ca un factor de stimulare 

(forma defosforilată fiind inactivă). O explicaţie ar 

putea fi că enzima III Glc fosforilată fosforilează la 

rândul ei un aminoacid (probabil histidina sau cisteina) 

din domeniul reglator al AC, oprind astfel inhibiţia 

[11]. În absenţa glucozei, AC este fosforilată 

în totalitate şi are o înaltă activitate enzimatică. 

Compararea diferitelor AC din această clasă a 

permis identificarea a două histidine conservate şi se 

presupune că una dintre ele este fosforilată. Nu a fost 

depistată în Escherichia coli prezenţa unei proteine 

fosforilate de 95 kDa. 

O proteină oarecum similară cu RAS (activator 

al ciclazei Saccharomyces cerevisiae) există şi în Escherichia 

coli. Factorul de elongare Tu, o proteină 

care leagă GTP, activează AC prezentă în Escherichia 

coli, însă nu se cunoaşte încă modul în care interacţionează 

cu AC. Aceasta sugerează ca şi în cazul 

majorităţii eucariotelor, că ciclazele enterobacteriene 

par a fi reglate prin intermediul proteinei G [12]. 

La enterobacterii, toate caracteristicile majore 

ale genei cya din Escherichia coli (ca numărul promotorilor 

şi genele din amonte şi aval) sunt conservate. 

AC Salmonellei typhimurium, ca şi cea a 

Esche richiei coli, este controlată de trei promotori şi 

este de asemenea inhibată de complexul AMPc - receptor 

pentru AMPc [13]. Gena Pasteurellei multocida 

este foarte asemănătoare cu cea de la entero - 

bacterii, însă organizarea locală a genelor este diferită. 

Gena din H. influenzae prezintă similitudini cu 

omoloaga sa din E. coli. Datele indică faptul că mecanismul 

de reglare a activităţii proteinelor corespunzătoare 

pare să fie conservat în această clasă. 

Expresia genică diferă la specii ca Pasteurella, Haemophillus 

sau Aeromonas, comparativ cu cea de la 

Enterobacteriaceae [1]. 

ADENILAT CICLAZELE BACTERIILOR PA- 

TOGENE (ADENILAT CICLAZELE DE CLASĂ 

II) 

O strategie adoptată de bacteriile patogene este 

creşterea nivelului de AMPc prin secreţia de toxine 

cu activitate de adenilat ciclază. Acestea intră în celulele 

ţintă şi, după activarea lor de factori specifici 

din eucariote (precum CaM), declanşează sinteza intracelulară 

de AMPc. Au fost identificate şi studiate 

patru astfel de toxine: AC invazivă din Bordetella 

pertussis, factorul edematos al Bacillus anthracis, 

AC (ExoY) a Pseudomonas aeruginosa şi AC din 

Yersinia pestis. 

Principala ţintă a acestor toxine o reprezintă celulele 

efectoare ale sistemului imun. Modificarea 

concentraţiei intracelulare a AMPc duce la modificări 

ale proceselor celulare, ce influenţează sistemul 

imun şi facilitează supravieţuirea bacteriei în organism. 

Aceasta reprezintă, de cele mai multe ori, o 

etapă critică în patogenia multor boli infecţioase. 

1. Adenilat ciclaza Bodetellei pertussis 

Bacteriile din genul Bordetella sunt cocobacili 

gram negativi, aerobi, care determină infecţii ale 

tractului respirator al mamiferelor. Bordetella pertussis 

produce o afecţiune înalt contagioasă numită 

tuse convulsivă. Această boală este iniţiată în momentul 

aderării bacteriei la epiteliul respirator şi colonizării 

sale. 

76

Implicarea adenilat ciclazelor în patogenitate, un minireview 

Bordetella pertussis produce mai multe toxine, 

printre care AC invazivă (CyaA) şi toxina pertussis, 

ambele fiind esenţiale pentru virulenţa bacteriei. AC 

determină o creştere rapidă a nivelelor intracelulare 

de AMPc, necesare pentru iniţierea colonizării (în 

primele zile după infecţie). Acumularea AMPc în celulă 

duce la inhibarea funcţiilor celulare şi a mecanismelor 

de apărare [14, 15]. Cercetările au arătat că 

CyaA parţial purificată poate inhiba fagocitoza prin 

alterarea chemotaxiei şi a răspunsului oxidativ, prin 

creşterea AMPc intracelular şi poate determina apoptoza 

macrofagelor. Toxina pertussis, ce acţionează mai 

târziu, amplifică semnalul AMPc, jucând astfel un rol 

important în persistenţa bacteriei în organism [16]. 

AC a fost menţionată ca exotoxină, pentru prima 

dată, în 1973 [17], iar după trei ani s-au făcut primele 

încercări de purificare [18]. Ulterior, în 1980, s-a observat 

că CyaA este activată de CaM [19]. 

Proteina este secretată printr-un mecanism specific 

bacteriilor gram negative, care este similar eliberării 

hemolizinei din Escherichia coli [20]. În 

general, pentru secreţia proteinelor bacteriilor Gram 

negative, este necesară prezenţa unui peptid semnal 

la capătul N-terminal. Acesta determină translocarea 

lor în periplasmul bacteriei, după care peptidul este 

clivat şi proteina exportată printr-un mecanism specific. 

S-a observat că AC din Bordetella pertussis nu 

prezintă acest semnal peptidic, ceea ce indică faptul 

că ea nu este secretată prin mecanismul obişnuit de 

secreţie. Pentru secreţia proteinei CyaA, sunt necesare 

trei gene (cyaB, cyaD şi cyaE) situate în aval 

(downstream) faţă de gena cyaA (gena pentru adenilat 

ciclază). Toate sunt organizate într-un singur operon 

şi aflate sub controlul promotorului cyaA [16]. 

În cazul hemolizinei (Escherichiei coli) sunt necesare 

genele hlyB şi hlyD, a treia (hlyC) fiind implicată 

în activarea proteinei. Gena cyaC, omoloaga 

genei hlyC, este situată în amonte (upstream) faţă de 

gena cyaA. Ordinea genelor în genomul Bordetellei 

pertussis este: cyaC, cyaA, cyaB, cyaD şi cyaE [1]. 

Transcrierea genei cyaA, ca şi a celorlalte gene implicate 

în virulenţă, este reglată de semnale din mediul 

înconjurător. 

Clonarea AC din Bordetella pertussis a avut un 

rol important în analiza structurii şi a funcţiei acestei 

proteine. Prima adenilat ciclază purificată şi studiată 

din punct de vedere biochimic este cea a Bordetellei 

pertussis şi exprimată în Escherichia coli. În ciuda 

numeroaselor încercări, gena cyaA din Bordetella 

pertussis a fost clonată abia în 1988 [21]. 

Sintetizată sub formă inactivă, AC este activată 

prin palmitoilarea a două resturi de lizină aflate în 

poziţiile 860 şi 983 [22], proces dependent de produsul 

genei cyaC [20]. 

AC prezentă în Bordetella pertussis este o proteină 

de 1706 aminoacizi, cu o structură modulară 

cu două domenii funcţionale. Primii ~400 aminoacizi 

(capătul N-terminal) constituie domeniul catalitic 

activat de CaM. Restul de 1306 aminoacizi 

(situaţi în regiunea C-terminală) formează o hemolizină 

cu rol în legarea şi internalizarea domeniului 

catalitic în celula eucariotă. Cele două domenii pot 

funcţiona independent unul de celălalt [23]. 

Proteina completă are o masă moleculară de 200 

kDa. Prin digestia proteinei cu enzime proteolitice 

se obţine un fragment de 43 kDa (domeniul catalitic) 

cu o activitate enzimatică similară cu cea a proteinei 

întregi [24]. 

CyaA poate interacţiona cu diferite tipuri de celule, 

însă principala ţintă a toxinei o constituie celulele 

efectoare ale sistemului imun. Aceasta îşi 

injectează domeniul catalitic în citosolul celulei 

gazdă, unde, după activarea de către CaM, produce 

cantităţi mari de AMPc. Domeniul catalitic pare a fi 

translocat prin membrana celulei ţintă direct în citosol 

printr-un proces de internalizare. Există câteva 

dovezi care privesc mecanismul de translocare. În 

primul rând, se poate detecta creşterea nivelului de 

AMPc intracelular, la câteva secunde după adăugarea 

toxinei CyaA. Pătrunderea prin vezicule necesită 

un timp mai îndelungat şi este dependentă de pH-ul 

veziculelor endocitare. Şi, nu în ultimul rând, CyaA 

poate invada celulele care au un transport membranar 

redus, cum ar fi eritrocitul mamalian [20]. 

Recent a fost propus un model pentru mecanismul 

de internalizare a AC în celule. Acesta implică 

doi conformeri distincţi care utilizează acelaşi segment 

al subdomeniului hidrofob din domeniul hemo - 

litic al AC. Un conformer formează pori oligomerici 

selectivi pentru cationi, care determină efluxul de 

potasiu din fagocit. Celălalt conformer este monomer 

şi răspunde de translocarea AC în celulă [25, 26, 

27]. Domeniul catalitic este depliat şi translocat prin 

membrană. Acest proces de pătrundere în interiorul 

celulei eucariote este dependent de calciu. Legarea 

Ca 2+ determină modificări conformaţionale ale proteinei, 

de la forma globulară la forma alungită. 

Translocarea domeniului AC în celula gazdă permite 

afluxul Ca 2+ printr-un mecanism specific [28]. S-a 

demonstrat că regiunea 375-385 joacă un rol crucial 

în inserarea în membrană şi translocarea AC din Bordetella 

pertussis [29]. 

Domeniul catalitic al adenilat ciclazei Bordetella 

pertussis 

Odată ajunsă în celulă, proteina este activată 

(prin modificarea conformaţiei domeniului catalitic) 

de lobul C-terminal al CaM şi catalizează sinteza 

77


AMPc [19] (Fig. 1). Experimentele au arătat că enzima 

rămâne asociată membranei, cu domeniile de 

legare a ATP şi CaM expuse citosolului. Situsul de 

legare pentru ATP se află între aminoacizii 54-70 şi 

are secvenţa 54 GVATKGLGVHAKSSDWG 70 . Studiile 

de fluorescenţă au arătat că AC formează cu 

CaM un complex strâns legat prin mai multe puncte 

de contact. AC din Bordetella pertussis prezintă o 

mare afinitate pentru CaM, complexul format având 

o activitate enzimatică de peste 1000 ori mai mare 

faţă de enzima nativă. Ionii de Ca 2+ legaţi de CaM 

contribuie la stabilizarea complexului AC-CaM [30]. 

Domeniul catalitic este alcătuit din două subdomenii: 

T 25 şi T 18 (obţinute in vitro prin proteoliză limitată). 

În T 25 (aminoacizii 1-224 = P 1-224 ) se 

gă seşte situsul catalitic, iar T 18 (aminoacizii 225- 

399 = P 225-399 ) conţine domeniul de legare a CaM 

[20]. Fragmentul N-terminal de 224 aminoacizi prezintă 

doar 0,1% din activitatea enzimei native. Se 

pare că acest fragment este deosebit de important în 

formarea centrului catalitic activ, dar în absenţa celuilalt 

fragment (care acţionează ca un activator al 

primului) nu poate avea activitate maximă, aminoacidul 

N 304 din structura CyaA fiind implicat în cataliză 

[31]. S-a dovedit experimental că fragmentul 

196-267 (parţial suprapus peste secvenţa celor două 

regiuni T 25 şi T 18 ) joacă un rol important în legarea 

CaM. Regiunile de contact între CyaA şi CaM includ 

patru segmente ale AC: H 197 –R 206 , R 235 –R 246 , R 250 – 

R 259 şi E 346 –R 360 . Studiile de cristalografie şi mutageneză 

dirijată au demonstrat că triptofanul W 242 este 

aminoacidul cheie implicat în legarea CaM. Acesta 

interacţionează cu segmentul C-terminal al CaM, 

fiind înconjurat, în buzunarul hidrofob, de I 125 , F 141 

şi patru reziduuri de metionină (M 169 , M 124 , M 144 şi 

M 145 ) [31]. Un alt rol important în legarea CaM este 

jucat de aminoacizii: R 258 , R 259 şi E 356 . [32]. 

Cele două subdomenii (T 25 şi T 18 ), odată sepa - 

rate, se reasociază, cu refacerea activităţii enzimatice 

în prezenţa CaM [33]. 

Domeniul de legare a CaM din miozin kinaza 

din muşchiul neted al găinii ( 494 RRKWQKTGHA- 

VRAIG 505 ) are o secvenţă similară cu un fragment 

din AC a Bordetellei pertussis, aflat în jumătatea N- 

terminală a centrului catalitic activ ( 164 RRKGGDD - 

FEAVKVIG 178 ), iar înlocuirea primilor trei ami no - 

acizi (RRK) cu resturi de acid glutamic duce la scăderea 

afinităţii AC pentru CaM. Aceasta se poate datora 

faptului că stabilizarea complexului AC-CaM se 

face prin interacţia dintre aminoacizii încărcaţi negativ 

ai CaM şi cei bazici (ca fragmentul RRK) ai 

AC [1]. CaM este necesară atât pentru declanşarea 

activităţii catalitice, cât şi pentru legarea nucleotidului 

la centrul catalitic activ al AC a Bordetellei pertussis. 

În interiorul situsului catalitic activ s-a identificat 

prezenţa a patru aminoacizi, cu rol esenţial atât 

în legarea ATP, cât şi din punct de vedere catalitic. 

Aceştia sunt: K 58 şi K 65 care aparţin unor secvenţe 

de tipul G——GK(T/S), precum şi D 188 şi D 190 din 

regiunea 184 PLTADID 190 . Toţi patru interacţionează 

cu Mg 2+ -ATP (la nivelul grupărilor fosfat din poziţiile 

α şi β) [1]. 

Activitatea enzimatică a AC este dependentă de 

prezenţa cationilor divalenţi, dar nu este influenţată 

de prezenţa α-cetoacizilor sau a guaninei. Diferite 

substanţe amfifile, cum ar fi fosfatidil-colina, fosfatidil-etanolamina 

şi fosfatidil-serina, s-au dovedit a 

avea un efect stimulator asupra activităţii enzimatice 

a acestei proteine [34]. 

Domeniul cu activitate de hemolizină al adenilat 

ciclazei Bordetellei pertussis 

La capătul C-terminal al proteinei, după domeniul 

catalitic, se află o secvenţă de 1300 de aminoacizi 

similară cu α-hemolizina din Escherichia coli. 

Domeniul este reprezentat de aminoacizii 400-1706, 

cu o activitate hemolitică dependentă de Ca 2+ şi are 

rolul de a traversa domeniul catalitic prin învelişul 

bacterian şi apoi prin cel al celulelor eucariote ţintă, 

fiind capabil să formeze canale ionice (selective pentru 

cationi) în membrana eucariotă. Este împărţit în 

trei subdomenii. Primul, localizat la nivelul aminoacizilor 

500-700, regiune formatoare de pori, este 

bogat în aminoacizi hidrofobi care formează patru 

potenţiale regiuni transmembranare [35]. Al doilea 

se situează între aminoacizii 700-1000 şi se aseamănă 

domeniului intern al α-hemolizinei Escherichiei 

coli, segment la nivelul căreia se produce 

palmitoilarea K 983 şi K 860 dependentă de CyaC [22]. 

Ambele subdomenii sunt necesare pentru formarea 

de canale în bistratul lipidic membranar [36]. Al treilea, 

aflat între aminoacizii 1006-1638, alcătuit din 

38-42 nonapeptide bogate în glicină şi aspartat, este 

implicat în legarea ionilor de Ca 2+ şi în interacţia cu 

membrana celulelor ţintă [37, 38]. 

2. Adenilat ciclaza Bacillus anthracis 

Antraxul este, în principal, o zoonoză transmisibilă 

şi la om prin contact cu animale infectate sau 

produse din animale contaminate. Boala este cauzată 

de o bacterie gram pozitivă, aerobă, sporulată, numită 

Bacillus anthracis. Este iniţiată prin pătrunderea 

sporilor în organism. 

Complexul toxic al antraxului are un caracter 

binar, componentele acestuia exprimându-se independent. 

Componenta enzimatică (factorul letal - LF 

şi factorul edematos - EF) acţionează în prezenţa 

78


substratului aflat în citosol, în timp ce componenta 

de legare (antigenul protector - PA) este o proteină 

multifuncţională care se leagă la receptorii de pe suprafaţa 

celulelor ţintă. În urma legării, are loc clivarea 

acesteia de către alte proteine de suprafaţă (de 

ex. furina), cu eliberarea unui fragment de 20 kDa 

de la capătul N-terminal. Fragmentul rămas de 63 

kDa (numit PA 63 ) este supus apoi oligomerizării, 

pentru a forma un heptamer inelar care leagă competitiv 

până la trei molecule (EF, LF sau ambele) 

[39]. Complexul rezultat suferă o endocitoză mediată 

de receptor. Ulterior, modificările conformaţionale 

datorate creşterii acidităţii din endosom duc la 

inserţia heptamerului în membrana endosomală şi la 

translocarea ulterioară a LF şi EF în citosol, unde îşi 

exercită efectul toxic asupra celulei gazdă. Deleţia 

PA influenţează virulenţa bacteriei [40]. 

Luate separat, cele trei proteine PA, LF, EF nu 

sunt toxice. Combinaţia între PA şi LF, numită şi toxina 

letală, duce la moartea animalelor de laborator, 

în timp ce combinaţia între PA şi EF, numită şi toxina 

edematoasă, induce creşterea nivelelor de AMPc intracelulare 

şi produce edem [41]. 

LF este o metaloproteinază dependentă de Zn, 

care clivează anumite izoforme de MAP kinaze ducând 

la moartea macrofagelor şi inhibarea proliferării 

celulare. EF este o adenilat ciclază dependentă de 

CaM şi Ca 2+ , care produce creşterea puternică a nivelelor 

intracelulare de AMPc, interferând cu semnalizarea 

celulară [42, 43]. EF singură nu este toxică, 

dar este necesară supravieţuirii sporilor germinaţi, în 

stadiile incipiente ale infecţiei [40]. 

S-a demonstrat că, după translocarea EF în citosol, 

se declanşează un influx crescut de Ca 2+ . Absenţa 

Ca 2+ sau prezenţa unor antagonişti ai canalelor 

de Ca 2+ în mediul extracelular previne acumularea 

intracelulară a AMPc [16, 44]. Odată ajuns în citoplasmă, 

EF este activat de CaM şi catalizează sinteza 

de AMPc din ATP. 

Genele răspunzătoare de virulenţă sunt localizate 

în două plasmide: pXO1 (182 kb) şi pXO2 (95 

kb). Plasmida pXO1 conţine genele pagA, lef şi cya, 

care codifică componentele complexului toxic al antraxului 

şi anume proteinele PA, LF şi EF [42, 43]. 

Expresia celor trei gene este reglată coordonat la 

nivel transcripţional prin sistemul tampon carbo - 

nat/bicarbonat şi prin temperatură [16]. Plasmida 

pXO2 conţine genele capA, capB şi capC, implicate 

în formarea capsulei. 

Gena cya codifică o proteină cu 800 de aminoacizi, 

cu o secvenţă semnal de 33 reziduuri de aminoacizi, 

aflată la capătul N-terminal şi care este îndepărtată 

după secreţie. Structura EF a fost determinată prin 

studii de cristalografie de raze X, făcute în prezenţa 

şi absenţa CaM. Această proteină este alcătuită din 

două domenii funcţionale. Domeniul N-terminal de 

30kDa, care prezintă o înaltă omologie cu cel din LF, 

este domeniul de legare la PA. Fragmentul 1-28 conţine 

un procent mare de reziduuri cu mare încărcătură 

electrică. Fragmentul 136 VYYEIGK 142 , identic 

cu secvenţa 147 VYYEIGK 153 al LF, este implicat în 

legarea PA. Iar înlocuirea resturilor de Y 137 , Y 138 , 

I 140 şi K 142 cu A aboleşte capacitatea EF de a se lega 

la PA. Domeniul catalitic (de 58kDa) este situat imediat 

după cel de legare PA la nivelul reziduurilor 

262-767. Este dependent de CaM (Fig. 1.). Nici o 

activitate nu poate fi detectată în absenţa ei, complexul 

Ca 2+ -CaM fiind un activator pentru EF mult mai 

puternic decat CaM singură [45]. 

Domeniul catalitic al adenilat ciclazei Bacillus 

anthracis 

Domeniul catalitic este alcătuit din 2 subdomenii: 

unul spre partea N-terminală, care conţine centrul 

catalitic, şi celălalt la capătul C-terminal, care 

leagă CaM. 

AC al Bacillus anthracis este dependentă de 

CaM şi de ioni divalenţi ca Mg 2+ şi Ca 2+ . Ionii de 

Ca 2+ sunt necesari pentru a forma complexul Ca 2+ - 

CaM, cu mare afinitate pentru enzimă (acest complex 

având un efect activator mai puternic decât 

CaM singură [45]). Mg 2+ formează cu ATP complexul 

Mg 2+ -ATP care acţionează ca substrat. Ca 2+ poate 

înlocui Mg 2+ , formând un complex cu ATP cu afinitate 

de cinci ori mai mare pentru situsul activ, dar 

care reduce viteza de reacţie enzimatică de 250 de 

ori. Domeniul catalitic al EF prezintă trei domenii 

globulare [46, 47]. Studiile asupra structurii secundare 

a AC au dus la concluzia că aceasta prezintă 

34% structuri β, 10% structuri α-helix şi 14% structuri 

“β-turn” [48]. S-a observat că valoarea pI a proteinei 

(fără domeniul N-terminal de 261 de ami noacizi 

răspunzător de interacţia acesteia cu PA), creşte 

peste 8, în comparaţie cu cea nativă care are un pI 

de 6,45 [1]. 

Predicţia structurii secundare, precum şi studiile 

de dicroism circular şi spectroscopie RMN, sugerează 

că segmentul situat între aminoacizii 548 şi 

564 a AC prezentă în Bacillus anthracis ar putea lua 

parte la legarea CaM. Prin folosirea unui peptid sintetic, 

s-a observat că secvenţa de aminoacizi 532-565 

al acestei proteine prezintă o afinitate crescută pentru 

CaM. Acest segment, ca şi alte peptide cunoscute 

care leagă CaM, prezintă în mare parte aminoacizi 

bazici şi hidrofobi, separaţi în două fragmente de o 

structură α-helix [49]. La legarea CaM, sunt implicate 

patru regiuni din structura EF: 510-540, 615- 

79


634, 647-672 şi 695-721, K 525 fiind aminoacidul 

cheie implicat în legare [46]. Fragmentul 579-590 

formează o buclă catalitică cu rolul de a stabiliza legarea 

de CaM [46, 50]. 

În urma legării CaM, se produc modificări conformaţionale 

care duc la formarea unui situs cu înaltă 

afinitate pentru legarea ATP. Acest situs, identificat 

prin mutageneză dirijată, se află la nivelul 

314GxxxxGKS 321 (o secvenţă consens). Prin înlocuirea 

K 320 cu N are loc scăderea de 10 ori a activităţii, 

în raport cu proteina nativă. Structura cristalină a EF 

sugerează că H 351 (H 318 , dacă se ia în considerare 

proteina fără secvenţa semnal) are un rol important 

în cataliză [46]. Cu toate acestea, rezultatele cristalografice 

şi de mutageneză arată că H 351 nu serveşte 

ca bază catalitică, el putând fi răspunzător pentru deprotonarea 

grupării 3’OH a ATP [50]. R 329 , K 346 , 

K 353 şi K 372 sunt implicaţi în legarea strânsă a ATP 

la centrul catalitic activ al enzimei [48, 50]. Aminoacizii 

D 491 şi D 493 au o contribuţie importantă în activitatea 

AC de legare a doi ioni metalici pentru a 

stabiliza intermediarul de reacţie [50]. Studii de activitate 

enzimatică au demonstrat că EF are o activitate 

mare, cu V max de 1,2 mmol AMPc/min/mg de 

proteină. EF este foarte sensibil la concentraţia Ca 2+ , 

având o activitate optimă la 0,2 mM şi fiind inhibat 

de concentraţii mari [45]. 

3. Adenilat ciclaza Pseudomonas aeruginosa 

(ExoY) 

Se cunosc trei specii de Pseudomonas care produc 

infecţii la subiecţi umani. Pseudomonas mallei 

produce răpciuga (morva) la cai, dar poate infecta şi 

omul. Pseudomonas pseudomallei produce melioidoză, 

o boală tropicală care afectează deopotrivă oamenii 

şi animalele. Pseudomonas aeruginosa, bac terie 

aerobă gram negativă, se găseşte predominant în 

sol şi apă. Este un patogen comun pentru plante şi animale. 

Este un agent patogen oportunist care produce 

infecţii ale tractului urinar şi ale sistemului respirator, 

dermatite, infecţii ale ţesuturilor moi, bacteriemie şi 

o varietate de infecţii sistemice, în special la persoanele 

cu arsuri grave, cancer sau SIDA, în general la 

persoane imunosupresate. Infecţia cu Pseudomonas 

aeruginosa prezintă trei etape: ataşarea şi colonizarea, 

invazia locală şi diseminarea în organism [16]. 

În patogeneza Pseudomonas aeruginosa sunt 

implicaţi diferiţi determinanţi ca unele proteaze, alginatul, 

fosfolipazele şi toxinele. Un determinant important 

pentru virulenţă este regulonul ExoS, a cărui 

expresie este corelată cu diseminarea bacteriei de la 

locul colonizării în sistemul vascular. Regulonul 

ExoS reprezintă un set de gene pentru virulenţă, reglate 

în mod coordonat la nivel transcripţional de 

ExsA (o proteină reglatoare din familia AraC). 

Acesta îşi reglează propria sinteză, precum şi a unor 

operoni care codifică proteine implicate în citotoxicitatea 

eucariotelor, proces realizat prin intermediul 

unei secreţii de tip III, la care participă trei clase de 

proteine: componente ale aparatului de secreţie, proteine 

care mediază translocaţia efectorilor în celula 

gazdă şi proteine efectoare care perturbă procesele 

celulare normale [16]. Translocarea efectorilor duce 

la inhibarea fagocitozei, ceea ce permite multiplicarea 

bacteriei şi lezarea epiteliului. S-au identificat 

patru proteine efectoare, aparţinând regulonului 

ExoS: ExoS – o proteină bifuncţională cu activitate 

de activator N-terminal al GTP-azelor (GAP) şi 

ADP-riboziltransferazică, ExoU – cu o activitate de 

fosfolipază A2 care determină citotoxicitate acută, 

ExoT - o proteină bifuncţională înrudită cu ExoS şi 

ExoY – o AC [51, 52]. ExoU şi ExoS nu pot fi găsite 

împreună în aproape nici o tulpină, însă proteinele 

ExoT şi ExoY sunt codificate de aproape toate tulpinile. 

Toate cele patru proteine efector necesită câte 

un cofactor din celula gazdă pentru activare [52]. 

Infecţia celulelor eucariote cu tulpini de Pseudomonas 

aeruginosa care exprimă AC (ExoY) duce 

la creşteri ale nivelelor de AMPc intracelular, precum 

şi la modificări morfologice ale celulei ca fragmentări 

ale citoscheletului şi rotunjirea celulelor. 

Acestea duc la inhibarea temporară a internalizării 

bacteriei în celulele epiteliale [53]. Aceste efecte nu 

se pot observa atunci când aparatul de secreţie de tip 

III este inactivat (prin mutaţii sau deleţii) sau se produce 

o formă inactivă de ExoY. Simpla adăugare de 

ExoY nu duce la creşterea nivelului de AMPc, ceea 

ce dovedeşte faptul că ExoY este introdusă în celulă 

printr-un mecanism de translocare de tip III (numit 

şi translocare polarizată) [16, 54]. 

ExoY este o proteină de 42 kDa codificată de o 

genă de 1134 pb. Este o proteină termolabilă. Resturile 

de aminoacizi 41-107 şi 209-221 din ExoY 

prezintă omologie cu secvenţe ale EF din Bacillus 

anthracis şi ale AC invazive din Bordetella pertussis. 

Prima regiune conservată (cea între 41-107) conţine 

situsurile pentru ATP/GTP, situsuri care leagă α-fosfatul. 

Cea de-a doua regiune conservată (aflată între 

209-221) leagă β şi γ- fosfaţii din ATP şi prezintă 

omologie cu o serie de proteine care leagă nucleotide, 

incluzând piruvatkinaza şi fosfofructokinaza 

[16]. ExoY nu conţine sevenţe asemănătoare domeniilor 

de legare a CaM la AC din Bordetella pertussis 

sau Bacillus anthracis. Altă trăsătură distinctă este 

prezenţa a cinci cisteine în molecula ExoY. Pentru 

stimularea activităţii enzimatice, ea necesită o proteină 

eucariotă, diferită de CaM şi care nu a fost încă 

80


identificată [54]. Stimularea activităţii ExoY poate 

fi o strategie pentru prevenirea generării de AMPc 

în interiorul bacteriei. Prin mutageneză dirijată au 

fost identificaţi aminoacizii esenţiali pentru activitatea 

enzimatică a ExoY, aceştia fiind K 81 , K 88 , D 212 

şi D 214 [16]. 

4. Adenilat ciclaza Yersiniei pestis 

Genul Yersinia cuprinde 11 specii, din care trei, 

Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica şi Yersinia 

pseudotuberculosis, sunt patogene pentru om. Ele 

determină un spectru larg de boli, de la ciuma pulmonară 

până la gastroenterita acută. Yersinia pestis, 

bacterie gram negativă, imobilă, nesporulată, este un 

bacil pleomorf care nu fermentează lactoza. Acest 

bacil aerob, facultativ anaerob, produce ciuma. Yersinia 

pestis este un patogen preponderent al rozătoarelor, 

transmiterea la om facându-se accidental, prin 

intermediul puricilor. La om, majoritatea celulelor 

bacteriene sunt fagocitate şi omorâte de leucocite polimorfonucleare 

(PMN). Puţinii bacili care sunt internalizaţi 

în macrofage, supravieţuiesc şi sinteti - 

zează factori de virulenţă. Prin spargerea celulei, 

aceştia sunt eliberaţi în mediul extracelular, declanşând 

infecţii sistemice. Infecţiile pulmonare prezintă 

o rată de mortalitate foarte mare [16]. 

În Yersinia pestis s-au identificat trei forme de 

adenilat ciclază: cea legată de membrană, cea citoplasmatică 

şi cea secretată în mediul extracelular. 

Forma extracelulară este o proteină de 30kDa. Nu se 

ştiu prea multe despre rolul acestei AC, însă s-a arătat 

că proteina suprimă metabolismul oxidativ al leucocitelor 

peritoneale la şoarecii albi [55]. Din acest 

motiv, se presupune că ar fi un important factor de 

virulenţă. 

ADENILAT CICLAZELE DIN CLASA III 

AC din clasa III sunt prezente atât în procariote, 

cât şi în eucariote. Activarea acestor AC este iniţiată 

de legarea unor stimuli de receptorii de pe suprafaţa 

celulei. 

Au fost propuse patru subgrupuri (a-d) ale AC de 

clasă III, pe baza domeniilor catalitice. Subclasa IIIa 

prezintă motivul (F/Y)XX(F/Y)D la interfaţa dimerilor, 

precum şi motivul EKIK. Subclasa IIIb este caracteristică 

pentru AC sub formă de pseudodimer în 

bacterii şi mamifere (cea solubilă), activată de bicarbonat. 

Subclasa IIIc corespunde AC homodimere ale 

bacteriilor Gram pozitive şi Gram negative. Subclasa 

IIId este reprezentată de AC din protozoare, tripanosomatide 

şi ciuperci cu motivul YEVKY [56, 57]. 

La mamifere, au fost identificate şi clonate nouă 

izoforme de AC ataşate de membrană (subclasa IIIa) 

şi una solubilă (subclasa IIIb) (Tabelul 1) [58]. 

Deşi genele care codifică AC din clasa III nu 

sunt organizate în clustere, fiind dispersate pe mai 

mulţi cromozomi, enzimele au o topologie similară. 

Ele funcţionează ca dimeri: heterodimeri (mamifere), 

pseudoheterodimeri (metazoare) sau homodimeri 

(protozoare). Cataliza are loc la interfaţa 

dimerilor [56]. AC membranare ale mamiferelor prezintă 

două domenii transmembranare cu şase regiuni 

şi câteva posibile situsuri de fosforilare, care ar putea 

fi implicate în reglare. AC din creierul bovinelor are 

aceeaşi structură. Fiecare domeniu conţine şase regiuni 

hidrofobe transmembranare. Există două fragmente 

de aproximativ 350 şi 300 aminoacizi, una 

situată între prima şi a doua regiune transmembranară 

şi cealaltă la capătul C-teminal al proteinei. Ele 

formează centrul catalitic activ [1]. 

Deşi nivelul expresiei celor două jumatăţi (fiecare 

conţine câte un domeniu transmembranar şi 

unul citoplasmatic) ale AC din creierul bovinelor 

(ex primate separat) este foarte mare, activitatea enzimatică 

a fiecăreia este sub 1%, comparativ cu cea 

a proteinei întregi. Însă, ca şi în cazul AC din Borde - 

tella pertussis, activitatea acesteia creşte semnificativ 

după coexpresia celor două domenii [59]. 

Prima AC clonată de la mamifere a fost cea din 

creierul bovin, exprimată apoi în celule Sf9, vectorul 

utilizat fiind de orgine baculovirală. Această enzimă 

poate fi activată de CaM, forskolina şi G αs (subunitatea 

α a proteinei G care stimulează AC). Enzima 

recombinată este inhibată de subunităţile β şi γ ale 

proteinei G. Au mai fost clonate şi alte AC mamaliene, 

utilizând sonde obţinute din secvenţa celei bovine 

[60]. 

Există opt aminoacizi foarte importanţi pentru 

cataliza AC de clasă III: două reziduuri aspartat care 

coordinează doi cofactori metalici (Mg 2+ sau Mn 2+ ), 

perechea lizină - aspartat implicată în legarea selectivă 

a substratului, perechea arginină - asparagină, 

care stabilizează structura de tranziţie şi perechea arginină 

- lizină implicată în poziţionarea grupării pirofosfat 

[56, 61]. 

Toate tipurile de AC mamaliene, ataşate de 

membrană, sunt stimulate de G sα -GTP. Alţi factori 

stimulanţi sunt: forskolina (tipurile I-VIII), G βϒ (tipurile 

II, IV şi VII), protein-kinaza C (tipurile I, II, 

III, V şi VII). AC de tip I, III şi VII sunt singurele 

AC mamaliene care interacţionează cu CaM, aşa 

cum reiese din Fig. 1. Factori inhibitori ai AC sunt: 

protein-kinaza A, G iα -GTP şi Ca 2+ (tipurile V şi VI), 

G βϒ (tipurile I, III şi VIII), protein-kinaza C (tipurile 

IV şi VI). AC solubilă este diferită faţă de AC mamaliene, 

similară însă cu cea găsită în cianobacterii. 

Ea este activată de bicarbonat şi Ca 2+ [1, 56, 57, 61]. 

81


Proprieti 

Sensibile la 

complexul Ca 2 + - 

calmodulin 

Stimulate de 

subunitatea G 

a proteinei G 

Inhibate de Ca 2+ 

i de subunitatea 

G a proteinei G 

Neinfluenat de 

forskolin 

Izoformele 

adenilat ciclazelor 

Tip I 

Tip III 

Tip VIII 

Tip II 

Tip IV 

Tip VII 

Tip V 

Tabel 1. Izoformele adenilat ciclazelor mamaliene 

Tip VI (considerate 

i ca o subfamilie 

a tipului V) 

Tip IX (cea mai divergent 

din familia adenilat 

ciclazelor membranare) 

Sursa 

Creier i glanda medulo-suprarenal 

Creier i în epiteliul olfactiv 

Creier, plmân, testicule, glanda suprarenal, 

uter, inima 

Creier, muchiul scheletic, plmân i inima 

Creier, rinichi, ficat, plmân, esut adipos brun, 

uter 

Origine ubicuitar (înalt exprimate în creier) 

Inim, creier, rinichi, ficat, uter, glanda 

suprarenal, esut adipos brun 

Ubicuitare 

Solubil Adenilat ciclaza solubil Testicule 

Creier i în esut muscular 

Complexul CaM·- Ca 2+ este un puternic stimulator 

al AC de tip I şi VIII. Se presupune că există 

două domenii de legare a CaM în structura AC de tip 

I: unul situat între aminoacizii 495-522 şi celălalt 

între aminoacizii 1027-1050, ambele bogate în aminoacizi 

bazici. Analizele de fluorescenţă au arătat că 

secvenţa de la nivelul 495-522 este cea mai probabilă 

a fi un astfel de domeniu. Afinitatea acestui peptid 

pentru CaM este de şapte ori mai mare decât a 

proteinei întregi [59]. Pe de altă parte, situsul de legare 

a CaM din celelalte tipuri de AC diferă de 

acesta, unul din situsuri aflându-se în regiunea N- 

terminală, iar celălalt în regiunea C-terminală. Studiile 

au arătat că, pentru activarea in vitro a enzimei, 

este suficient cel din regiunea C-terminală, dar in 

vivo este necesar şi cel din regiunea N-terminală. 

Acelaşi complex CaM·- Ca 2+ acţionează ca un 

activator secundar al activităţii AC de tip III. Aceasta 

este activată în prealabil de către subunitatea α a proteinei 

G sau de către forskolină [57]. 

ADENILAT CICLAZE – ASEMĂNĂRI ŞI 

DEOSEBIRI 

Organizarea informaţiei genetice pentru AC din 

diverse surse este diferită. Astfel, gena pentru adenilat 

ciclază la Bordetella pertussis (cyaA) este situată 

într-un operon (aflat sub controlul promotorului 

cyaA). La Bacillus anthracis cya se găseşte într-una 

din cele două plasmide de virulenţă pe care le conţine 

(pXO1), iar la Pseudomonas aeruginosa, gena 

pentru ExoY aparţine regulonului ExoS, care este reglat 

de către proteina ExsA [16, 42, 43]. Genele pentru 

diferite tipuri de AC de clasă III sunt organizate 

pe mai mulţi cromozomi. Aceasta denotă faptul că 

expresia acestor enzime este reglată diferit, în funcţie 

de condiţiile de mediu. 

Structura acestor proteine enzimatice variază în 

funcţie de organismul din care provin şi de modul 

lor de acţiune. CyaA şi AC din Escherichia coli au o 

construcţie modulară, fiind alcătuite din două domenii 

funcţionale: unul catalitic şi altul hemolitic pentru 

Fig. 1 - Activarea AC de complexul Ca 2+ -CaM 

82


CyaA şi reglator pentru Cya din Escherichia coli 

[23]. EF din Bacillus anthracis apar ţine complexului 

toxic. Pentru a-şi exercita funcţia în celula gazdă, enzima 

trebuie mai întâi să interacţioneze cu PA. Domeniul 

catalitic al enzimei din Bacillus anthracis se 

află în zona C-terminală a proteinei, în timp ce la capătul 

N-terminal se găseşte domeniul de legare la PA 

[38]. Pentru enzimele din celelalte bacterii patogene, 

domeniul catalitic se află la capătul N-terminal (ex. 

CyaA, ExoY). La AC de clasă III situaţia este diferită, 

deoarece ele funcţionează ca dimeri cu situsul 

catalitic aflat la interfaţa dintre dimeri [56]. AC mamaliene 

membranare prezintă două domenii similare 

(fiecare având cate un subdomeniu transmembranar, 

alcătuit din şase regiuni hidrofobe şi un subdomeniu 

citoplasmatic) care nu pot funcţiona independent unul 

de celălalt [1]. 

AC din bacterii patogene prezintă trei regiuni 

înalt omoloage, însă mecanismele de secreţie şi pătrundere 

în celula eucariotă diferă. Internalizarea 

acestor toxine de către celulele gazdă eucariote se 

realizează prin intermediul domeniului hemolitic 

(care creează pori în membrană) în cazul Bordetella 

pertussis şi prin endocitoză în cazul Bacillus anthracis 

[16, 25, 26, 27, 39]. In ambele cazuri, internalizarea 

domeniului catalitic declanşează un aflux 

crescut de Ca 2+ în celula gazdă [16, 28, 44]. Ele sunt 

actívate de CaM [19, 42]. Un alt factor de virulenţă 

aflat la Pseudomonas aeruginosa, numit proteina 

ExoY, este o adenilat ciclază “injectată” în celula 

gazdă printr-un mecanism de tip III şi activată de un 

factor eucariot diferit de CaM [16, 54]. 

După pătrundere în citoplasmă, enzima interacţionează 

cu CaM (sau alt activator), determinând sinteza 

puternică a AMPc şi perturbarea funcţiilor 

celulare [14, 15, 41, 53]. AC din clasa II , dintre care 

toxina CyaA din Bordetella pertussis sau factorul 

edematos (EF), produs de Bacillus anthracis, prezintă 

nişte trăsături speciale, dintre care cea mai importantă 

este activarea acesteia de către CaM, 

proteină absentă în bacterie [19, 42, 43]. Dependenţa 

AC bacteriene de CaM reprezintă un aspect important 

al acestora deoarece CaM nu este sintetizată de 

bacterie. O activitate adenilat ciclazică constitutivă 

ar putea fi letală pentru bacterie. 

Deşi, la prima vedere, reactivitatea încrucișată 

a acestor ciclaze (în special a celor din Bordetella 

pertussis şi Bacillus anthracis) sugerează o structură 

similară, structura primară prezintă diferenţe im por - 

tante în ceea ce priveşte dimensiunea, precum şi o 

similitudine relativ scăzută a secvenţelor. Locaţia situsurilor 

de legare a ATP şi mecanismul de activare 

al AC din Bordetella pertussis şi Bacillus anthracis 

sunt asemănătoare. După ce am analizat secvenţele 

celor trei AC din bacterii patogene corespunzătoare 

domeniilor catalitice - respectiv CyaA din Bacillus 

Fig. 2 - Aliniamentul secvenţelor: CyaA din Bacillus anthracis (resturile 224-506), 

ExoY din Pseudomonas aeruginosa (resturile 1-255) şi CyaA din Bordetella pertussis (1-231) 

şi structura secundară propusă pentru domeniul catalitic al ExoY (vezi casuţa) 

83


Fig. 3 - Analiza structurii tridimensionale a fragmentelor de AC: 

A. Bacillus. anthracis CyaA (fragmentul 224-506); B. Bordetella pertussis CyaA (fragmentul 1-231) şi 

C. Bacillus anthracis CyaA (fragmentul 224-506) suprapus peste Bordetella pertussis CyaA (fragmentul 1-231) 

anthracis (resturile 224-506), ExoY din Pseudomonas 

aeruginosa (resturile 1-255) şi CyaA din Bordetella 

pertussis (1-231) - am ajuns la concluzia că 

situsul de legare a ATP din Pseudomonas aeruginosa 

ar putea fi: 80 TKGFSVKGKSS 90 (vezi căsuţa din 

aliniamentul din Fig. 2). Pe baza acestei analize a 

secvenţelor proteice şi a analizei structurii tridimensionale 

a acestor fragmente, propunem o structură 

secundară (evidenţiată în Fig. 2) pentru acest fragment 

din ExoY. 

AC sunt enzime larg răspândite, fiind prezente 

atât la procariote, cât şi la eucariote. Deşi au acelaşi 

tip de activitate (ciclizarea ATP), structura acestor 

proteine variază, depinzând atât de funcţie, cât şi de 

organismul care le produce. Analiza secvenţei domeniului 

catalitic de la diferite specii bacteriene cu 

structură tridimensională cunoscută face posibilă 

predicţia conformaţiei regiunii de legare a ATP şi la 

AC produse de alte tulpini bateriene. 

BIBLIOGRAFIE 

1. Barzu O. and Danchin A. Adenylyl Cyclases: A He - 

terogeneous Class of ATP-Utilizing Enzymes. Prog 

Nucleic Acid Res Mol Biol. 1994. 49:241-83. 

2. Baker DA, Kelly JM. Structure, function and evolution 

of microbial adenylyl and guanylyl cyclases. Mol Microbiol 

2004. 52(5):1229-42. 

3. Sismeiro O, Trotot P, Biville F, Vivares C, Danchin A., 

Aeromonas hydrophila adenylyl cyclase 2: a new class 

of adenylyl cyclases with thermophilic properties and 

sequence similarities to proteins from hyperthermophilic 

archaebacteria., J Bacteriol. 1998 Jul; 

180(13):3339-44. 

4. Smith N, Kim SK, Reddy PT, Gallagher DT., Crystallization 

of the class IV adenylyl cyclase from Yersinia 

pestis., Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 

2006 Mar 1;62(Pt 3):200-4. Epub 2006 Feb 10. 

5. Cotta MA, Whitehead TR & Wheeler MB (1998) Identification 

of a novel adenylate cyclase in the ruminal 

anaerobe, Prevotella ruminicola D31d. FEMS Microbiol 

Lett 164, 257–260. 

6. Tellez-Sosa J, Soberon N, Vega-Segura A, Torres-Marquez 

ME, Cevallos MA., The Rhizobium etli cyaC 

product: characterization of a novel adenylate cyclase 

class., J Bacteriol. 2002 Jul; 184(13):3560-8. 

7. Roy, A., P. Glaser, and A. Danchin. Aspects of the regulation 

of adenylate cyclase synthesis by Escherichia 

coli K-12. J. Gen. Microbiol. 1988. 134(2):359-67. 

8. Jovanovitch, S. B. Regulation of cya-lac fusions by 

cyclic AMP in Salmonella typhimurium. J Bacteriol. 

1985. 161(2):641-9. 

9. Mori, K., and H. Aiba. Evidence for negative control 

of cya transcription by cAMP and cAMP receptor protein 

in intact Escherichia coli cells. J Biol Chem. 1985. 

260(27):14838-43. 

10. Reddy, P. S., A. Peterkofsky, and K. McKenney. 

Translational efficiency of the E. coli adenylate cyclase 

gene: mutating the UUG initiation codon to 

GUG or AUG results in increased gene expression. 

Proc Natl Acad Sci U S A. 1985. 82(17):5656-60. 

11. Levy S., Zeng G.Q., and Danchin A. Cyclic AMP synthesis 

in Escherichia coli strains bearing known deletions 

in the pts phosphotransferase operon. Gene. 

1990. 86(1):27-33. 

12. Reddy P., Miller D. and Peterkofsky A., Stimulation of 

Escherichia coli adenylate cyclase activity by elongation 

factor Tu, a GTP-binding protein essential for protein 

synthesis. J Biol Chem. 1986 261(25):11448-51. 

13. Thorner, L. K., J. P. Fandl, and S. W. Artz. Analysis 

of sequence elements important for expression and 

84


regulation of the adenylate cyclase gene (cya) of Salmonella 

typhimurium. Genetics. 1990. 125(4):709-17. 

14. Confer DL, Eaton JW. (1982), Phagocyte impotence 

caused by an invasive bacterial adenylate cyclase., 

Science. 1982 Sep 3;217(4563):948-50. 

15. Hanski E., Invasive adenylate cyclase toxin of Bordetella 

pertussis, Trends Biochem Sci. 1989 Nov; 

14(11):459-63. 

16. Ahuja N, Kumar P, Bhatnagar R. The Adenylate Cyclase 

Toxins. Crit Rev Microbiol 2004. 30(3):187-196. 

17. Wolff J, Cook GH. Activation of thyroid membrane 

adenylate cyclase by purine nucleotides. J Biol Chem. 

1973, 248(1):350-5. 

18. Hewlett E, Wolff J. Soluble adenylate cyclase from the 

culture medium of Bordetella pertussis: purification and 

characterization. J Bacteriol. 1976, 127(2):890-8. 

19. Wolff J., Cook G. H., Goldhammer A. R., and Ber - 

kowitz S. A. Calmodulin activates prokaryotic adenylate 

cyclase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1980, 77(7): 

3841-844. 

20. Landant D., Ullmann A. Bordetella pertussis adenylate 

cyclase: a toxin with multiple talents. Trends Micobiol 

1999. 7(4): 172-6. 

21. Glaser P, Ladant D, Sezer O, Pichot F, Ullmann A, 

Danchin A. The calmodulin-sensitive adenylate cyclase 

of Bordetella pertussis: cloning and expression 

in Escherichia coli. Mol Microbiol 1988. 2(1):19-30. 

22. Masin J, Basler M, Knapp O, El-Azami-El-Idrissi M, 

Maier E, Konopasek I, Benz R, Leclerc C, Sebo P., 

Acylation of lysine 860 allows tight binding and cytotoxicity 

of Bordetella adenylate cyclase on CD11bexpressing 

cells., Biochemistry. 2005 Sep 27; 

44(38):12759-66. 

23. Sakamoto H, Bellalou J, Sebo P, Ladant D. Bordetella 

pertussis adenylate cyclase toxin. Structural and functional 

independence of the catalytic and hemolytic activities. 

J Biol Chem. 1992 267(19):13598-602. 

24. Bellalou J, Sakamoto H, Ladant D, Geoffroy C, Ullmann 

A. Deletions affecting hemolytic and toxin activities 

of Bordetella pertussis adenylate cyclase. 

Infect Immun. 1990, 58(10):3242-7. 

25. Vojtova-Vodolanova J, Basler M, Osicka R, Knapp O, 

Maier E, Cerny J, Benada O, Benz R, Sebo P., 

Oligomerization is involved in pore formation by Bordetella 

adenylate cyclase toxin., FASEB J. 2009 

Sep;23(9):2831-43. Epub 2009 May 5. 

26. Osickova A, Masin J, Fayolle C, Krusek J, Basler M, 

Pospisilova E, Leclerc C, Osicka R, Sebo P., Adenylate 

cyclase toxin translocates across target cell membrane 

without forming a pore., Mol Microbiol. 2010 

Mar;75(6):1550-62. Epub 2010 Feb 23. 

27. Fiser R, Masin J, Bumba L, Pospisilova E, Fayolle C, 

Basler M, Sadilkova L, Adkins I, Kamanova J, Cerny 

J, Konopasek I, Osicka R, Leclerc C, Sebo P., Calcium 

Influx Rescues Adenylate Cyclase-Hemolysin from 

Rapid Cell Membrane Removal and Enables Phagocyte 

Permeabilization by Toxin Pores, PLoS Pathog. 

2012 April; 8(4): e1002580. 

28. Fiser R, Masín J, Basler M, Krusek J, Spuláková V, 

Konopásek I, Sebo P., Third activity of Bordetella 

adenylate cyclase (AC) toxin-hemolysin. Membrane 

translocation of AC domain polypeptide promotes calcium 

influx into CD11b+ monocytes independently of 

the catalytic and hemolytic activities., J Biol Chem. 

2007 Feb 2; 282(5):2808-20. Epub 2006 Dec 4. 

29. Karst JC, Barker R, Devi U, Swann MJ, Davi M, 

Roser SJ, Ladant D, Chenal A., Identification of a region 

that assists membrane insertion and translocation 

of the catalytic domain of Bordetella pertussis CyaA 

toxin., J Biol Chem. 2012 Mar 16; 287(12):9200-12. 

Epub 2012 Jan 12. 

30. Selwa E, Laine E, Malliavin TE., Differential role of 

calmodulin and calcium ions in the stabilization of the 

catalytic domain of adenyl cyclase CyaA from Bordetella 

pertussis., Proteins. 2012 Apr; 80(4):1028-40. 

doi: 10.1002/prot.24005. Epub 2012 Jan 9. 

31. Guo Q, Shen Y, Lee YS, Gibbs CS, Mrksich M, Tang 

WJ. Structural basis for the interaction of Bordetella 

pertussis adenylyl cyclase toxin with calmodulin. 

EMBO J. 2005. 24(18):3190-201. 

32. Glaser P, Elmaoglou-Lazaridou A, Krin E, Ladant D, 

Bârzu O, Danchin A. Identification of residues essential 

for catalysis and binding of calmodulin in Bordetella 

pertussis adenylate cyclase by site-directed 

mutagenesis. EMBO J. 1989, 8(3):967-72. 

33. Dautin N., Karimova G., Ladant D. Bordetella pertussis 

adenylate cyclase toxin: a versatile screening tool. 

Toxicon 2002. 40: 1383–1387. 

34. Wolff J, Cook GH. Amphiphile-mediated activation 

of soluble adenylate cyclase of Bordetella pertussis. 

Arch Biochem Biophys. 1982 215(2):524-31. 

35. Osickova A, Osicka R, Maier E, Benz R, Sebo P., An 

amphipathic alpha-helix including glutamates 509 and 

516 is crucial for membrane translocation of adenylate 

cyclase toxin and modulates formation and cation selectivity 

of its membrane channels., J Biol Chem. 1999 

Dec 31;274(52):37644-50. 

36. Benz R, Maier E, Ladant D, Ullmann A, Sebo P (1994), 

Adenylate cyclase toxin (CyaA) of Bordetella pertussis. 

Evidence for the formation of small ion-permeable 

channels and comparison with HlyA of Escherichia 

coli., J Biol Chem. 1994 Nov 4; 269(44):27231-9. 

37. Welch RA. Pore-forming cytolysins of gram-negative 

bacteria. Mol Microbiol. 1991 5(3):521-8. 

38. Rose T, Sebo P, Bellalou J, Ladant D., Interaction of 

calcium with Bordetella pertussis adenylate cyclase 

toxin. Characterization of multiple calcium-binding 

sites and calcium-induced conformational changes., J 

Biol Chem. 1995 Nov 3; 270(44):26370-6. 

39. Collier RJ., Membrane translocation by anthrax toxin., 

Mol Aspects Med. 2009 Dec; 30(6):413-22. Epub 

2009 Jun 27. 

40. Levy H, Weiss S, Altboum Z, Schlomovitz J, Rothschild 

N, Glinert I, Sittner A, Kobiler D., The effect 

of deletion of the edema factor on Bacillus anthracis 

pathogenicity in guinea pigs and rabbits., Microb 

Pathog. 2012 Jan; 52(1):55-60. Epub 2011 Oct 17. 

41. Stanley JL, Smith H. Purification of factor I and 

recognition of a third factor of the anthrax toxin. J Gen 

Microbiol. 1961 26:49-63. 

42. Robertson DL, Leppla SH. Molecular cloning and expression 

in Escherichia coli of the lethal factor gene 

of Bacillus anthracis. Gene. 1986 44(1):71-8. 

43. Robertson DL, Tippetts MT, Leppla SH. Nucleotide 

sequence of the Bacillus anthracis edema factor gene 

85


(cya): a calmodulin-dependent adenylate cyclase. 

Gene. 1988 73(2):363-71. 

44. Kumar P, Ahuja N, Bhatnagar R., Anthrax edema 

toxin requires influx of calcium for inducing cyclic 

AMP toxicity in target cells., Infect Immun. 2002 Sep; 

70(9):4997-5007 

45. Leppla SH. Bacillus anthracis calmodulin-dependent 

adenylate cyclase: chemical and enzymatic properties 

and interactions with eucaryotic cells. Adv Cyclic Nucleotide 

Protein Phosphorylation Res. 1984 17:189-98. 

46. Drum C. L., Yan S. Z., Bard J., Shen Y. Q., Lu D., Soelaiman 

S., Grabarek Z., Bohm A. and Tang W. J. Structural 

basis for the activation of anthrax adenylyl 

cy clase exotoxin by calmodulin. Nature 2002. 

415(6870):396-402. 

47. Liddington R. C. Anthrax: a molecular full nelson. 

Nature 2002. 415(6870):373-4. 

48. Labruyère E, Mock M, Surewicz WK, Mantsch HH, 

Rose T, Munier H, Sarfati RS, Bârzu O. Structural and 

ligand-binding properties of a truncated form of Bacillus 

anthracis adenylate cyclase and of a catalytically 

inactive variant in which glutamine substitutes for lysine-346. 

Biochemistry. 1991 30(10):2619-24. 

49. Munier H, Blanco FJ, Prêcheur B, Diesis E, Nieto JL, 

Craescu CT, Bârzu O. Characterization of a synthetic 

calmodulin-binding peptide derived from Bacillus anthracis 

adenylate cyclase. J Biol Chem. 1993 

268(3):1695-701. 

50. Shen Y, Zhukovskaya NL, Guo Q, Florian J, Tang 

WJ., Calcium-independent calmodulin binding and 

two-metal-ion catalytic mechanism of anthrax edema 

factor., EMBO J. 2005 Mar 9; 24(5):929-41. Epub 

2005 Feb 17. 

51. Frank DW. The exoenzyme S regulon of Pseudo - 

monas aeruginosa. Mol Microbiol. 1997 26(4):621-9. 

52. Engel J, Balachandran P., Role of Pseudomonas aeru - 

ginosa type III effectors in disease., Curr Opin Microbiol. 

2009 Feb; 12(1):61-6. Epub 2009 Jan 23. 

53. Cowell BA, Evans DJ, Fleiszig SM., Actin cytoskeleton 

disruption by ExoY and its effects on Pseudomo - 

nas aeruginosa invasion., FEMS Microbiol Lett. 2005 

Sep 1;250(1):71-6. 

54. Yahr TL, Vallis AJ, Hancock MK, Barbieri JT, Frank 

DW., ExoY, an adenylate cyclase secreted by the 

Pseudomonas aeruginosa type III system., Proc Natl 

Acad Sci U S A. 1998 Nov 10; 95(23):13899-904. 

55. Shevchenko LA, Mishankin BN. Adenylate cyclase 

of the causative agent of plague: its purification and 

pro perties. Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol. 

1987, 15-20. 

56. Linder JU, Schultz JE., The class III adenylyl cyclases: 

multi-purpose signalling modules., Cell Signal. 

2003 Dec; 15(12):1081-9. 

57. Krupinski J, Coussen F, Bakalyar HA, Tang WJ, Fein - 

stein PG, Orth K, Slaughter C, Reed RR, Gilman AG. 

Adenylyl cyclase amino acid sequence: possible channel- 

or transporter-like structure. Science 1989. 

244(4912):1558-64. 

58. Sunahara R. K. and Taussig R. Isoforms of Mammalian 

Adenylyl Cyclase: Multiplicities of Signaling. 

Mol Interv. 2002. 2(3):168-84. 

59. Tang WJ, Krupinski J, Gilman AG. Expression and cha - 

racterization of calmodulin-activated (type I) adenylylcyclase. 

J Biol Chem. 1991, 266(13):8595-603. 

60. Linder J. U.. Class III adenylyl cyclases: molecular 

mechanisms of catalysis and regulation. Cell Mol Life 

Sci. 2006. 63(15):1736-51. 

61. William F. Simonds, G protein regulation of adenylate 

cyclase, Trends Pharmacol Sci. 1999 Feb; 20(2):66-73. 

86

Interior Archives_1(2013)_000pag_2-6 - RAMI Editorial Board

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?